睡眠剥夺上调小鼠胰腺 TNF-α的表达

刘 丽 君 何 菲 郭 珮 王 琦 王 弘 凯 冉 建 华*

（重庆医科大学：1基础医学院解剖学教研室；2神经科学研究中心，重庆 400016）

睡眠剥夺上调小鼠胰腺 TNF-α的表达

刘 丽 君1，2何 菲1，2郭 珮1，2王 琦1，2王 弘 凯1，2冉 建 华1，2*

（重庆医科大学：1基础医学院解剖学教研室；2神经科学研究中心，重庆 400016）

目的 探讨睡眠剥夺对小鼠胰腺形态、功能的影响以及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）表达变化的病理意义。方法 C57雄性小鼠随机分为正常对照组，睡眠剥夺24 h、48 h和60 h组，观察各组小鼠的精神活动状态及体重变化；检测血清淀粉酶（serum amylase，AMS）水平；采用 HE染色和免疫组织化学法观察各组小鼠胰腺的组织学特征及TNF-α表达情况；Western Blot检测 TNF-α的表达水平。结果 随睡眠剥夺时间的延长，模型组小鼠体重较正常对照组明显下降。AMS水平在睡眠剥夺24 h显著升高，48 h达到峰值后维持至60 h。HE染色可见睡眠剥夺组小鼠出现胰岛细胞排列紊乱、胞质浓缩、细胞间隙扩大；外分泌部细胞酶原颗粒消失，细胞空泡化等病理改变；免疫组化及免疫印迹显示，睡眠剥夺组小鼠胰腺中 TNF-α的表达随剥夺时间的延长而明显上调。结论 睡眠剥夺后不仅导致小鼠全身衰竭，并通过活化 TNF-α而诱导胰腺的炎症反应，导致其形态和功能损伤。

睡眠剥夺；胰腺；肿瘤坏死因子-α

在生活节奏日益加快、工作压力不断激增的今天，人们面临越来越多的应激事件，这种因工作或疾病等因素使得人们睡眠时间呈逐渐减少趋势的状态被称为睡眠剥夺（sleep deprivation，SD）。睡眠剥夺作为一种类似于缺氧的应激源，广泛影响机体各系统的生理功能，严重影响人们的生活质量，成为日益突出的医疗及公共卫生问题［1］。大量的实验研究表明［2-5］，睡眠剥夺可引起机体能量消耗增加，体重下降，免疫功能降低及条件性致病菌感染机会增加。目前，国内外对于睡眠剥夺病理机制的研究主要集中在神经系统和心血管系统，证实睡眠剥夺后引起的自由基产生增多，细胞抗氧化能力降低以及内质网应激三条途径所导致的氧化应激是睡眠剥夺诱发机体损伤的中心环节［6，7］。睡眠剥夺引起机体能量消耗的增加与氧化应激密不可分，氧化应激引起TNF-α增加导致的炎症反应是急性胰腺炎的重要病理机制［8］；然而，睡眠剥夺后氧化应激对胰腺形态和功能的影响如何却未见报道。因此，本研究利用改良多平台睡眠剥夺装置建立小鼠睡眠剥夺模型，拟探讨睡眠剥夺对胰腺组织结构、功能损伤的影响以及 TNF-α的表达意义，为改变不良生活方式，预防及降低睡眠剥夺引起的胰腺损伤提供实验依据。

材料和方法

1.材料

清洁级健康成年雄性 C57小鼠（体重16～21 g）48只由重庆医科大学实验动物中心提供。实验前适应性饲养1周，12 h光照（8：00-20：00），12 h黑暗，自由摄取水和食物，动物房温度保持在 22～24℃，湿度保持在60%～70%，避免噪音。

2.方法

2.1 实验分组

将小鼠随机分为4组，每组12只：正常对照组（Control，为排除隔离及水环境造成的影响而设置），睡眠剥夺24 h（SD 24 h）组，睡眠剥夺 48 h（SD 48 h）组，睡眠剥夺60 h（SD 60 h）组。

2.2 睡眠剥夺模型的建立

采用改良多平台水环境睡眠剥夺法［9］（Modifid Multiple Platrorm Water Environmental Method，MMPWM）建立睡眠剥夺模型。实验箱为 40 cm×30 cm ×20 cm透明水箱，其内分别设置20个直径2.0 cm、高5.0 cm的圆形平台，各平台之间间距为6 cm。箱体内注入自来水使其低于平台约 1.0 cm，水温保持在22℃左右，箱顶扣上栅栏式鼠笼盖，放置饲料和水瓶。小鼠在平台上可自由进食饮水，并可在平台间自由活动；若其睡眠，会因肌张力松弛而垂头触水或落入水中惊醒。正常对照组采用与睡眠剥夺组规格一致的透明水箱，但其内放置的平台大小直径为12.00 cm，小鼠在平台上可自由活动及睡眠。睡眠剥夺期间持续40 W日光灯照射，每日更换水及饲料。

2.3 血清学指标 AMS含量测定

各组小鼠在相应时间点以3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉，摘除眼球后经眼眶后静脉丛取血，将静脉血滴入4 ml消毒 EP管中静置10 min，以4000 r／min离心10 min，上清液采用HITACHI-7150型自动生化分析仪检测血清淀粉酶（serum amylase， AMS）含量。

2.4 HE染色

各组小鼠眼球取血后，固定于小动物实验台上，剪除毛发及消毒后迅速剪开腹部皮肤和胸骨以暴露心脏，以40 ml生理盐水经左心室冲洗后再以40 ml预冷的4%多聚甲醛灌流固定。取出胰腺置于4%多聚甲醛4℃过夜后用 30%蔗糖脱水，组织沉底后取出行常规石蜡包埋，连续切片，片厚6μm。切片经二甲苯和梯度酒精脱蜡水化后，苏木素染色 5 min，自来水洗 l min。盐酸乙醇分化30 sec，自来水浸泡15 min，置伊红液 2 min，经梯度乙醇脱水并依次脱色，最后用中性树脂封片。光镜观察小鼠胰腺组织的形态学变化。

2.5 免疫组织化学和蛋白免疫印迹

胰腺切片经二甲苯和梯度酒精脱蜡水化后，0.1 mol／L枸橼酸盐缓冲液修复抗原，PBS冲洗，3% H2O2溶液去除内源性过氧化物酶活性，滴加山羊血清工作液封闭非特异性结合位点（北京中杉金桥生物有限公司），37℃ 30 min；滴加 TNF-α工作液（1：400，博士德生物有限公司），湿盒内 4℃过夜；0.01M PBS冲洗后滴加生物素化二抗工作液，室温孵育30 min，0.01M PBS冲洗，DAB镜下显色，苏木素复染胞核，脱水、透明后中性树胶封片。

总蛋白提取试剂盒（碧云天公司）提取胰腺各组总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，10%凝胶SDSPAGE分离蛋白，电泳结束后转膜，5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗稀释液稀释的兔抗 TNF-α多克隆抗体（1：300）4℃孵育过夜，再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1：8000）杂交1 h，ECL显色液显色，胶片曝光，Image Tool分析软件对目的条带进行灰度值分析。

2.6 统计学分析

采用SPSS13.0软件处理实验数据。计数资料以均数 ±标准差（（±s））表示，多样本均数比较时，组间采用完全随机设计单因素方差分析比较，以 P＜0.05表示差异有显著性。

结 果

1.睡眠剥夺后小鼠一般状态

正常对照组小鼠摄食无明显变化，活动自如，对声光反应较灵敏。睡眠剥夺初期，小鼠兴奋性提高，对周围刺激反应敏捷；睡眠剥夺 24 h，小鼠表现出“激惹”现象，对抚摸刺激表现出尖叫、逃避，相互之间出现撕咬、打斗等明显的攻击行为；睡眠剥夺 48 h，小鼠较为虚弱，活动明显减少；睡眠剥夺 60 h，小鼠精神萎靡，全身颤抖，呼吸频率加快，站立不稳，对外界刺激反应淡漠，呈极度虚弱状态。

2.睡眠剥夺后小鼠体重的变化

实验前各组小鼠的体重无差异（P＞0.05）。正常对照组小鼠体重随时间延长略有增加。与正常对照组相较，小鼠的体重在 SD 24 h减少（P＜0.05），至 SD 48 h和SD 60 h体重呈逐渐减少趋势（P＜0.05）（图1）。

图1 正常对照组与睡眠剥夺组的体重变化。*示与对照组相比，P＜0.05，n＝48Fig.1 Changes of weight between control group and sleep deprivation groups.*P＜0.05 compared with the control group，n＝48

3.血清淀粉酶 AMS的变化

正常对照组AMS水平约为806±46.9 U／L，小鼠AMS在睡眠剥夺后显著升高，其中SD 24 h后高达2299±153.6 U／L，SD 48 h后达到2809±117.7 U／L的峰值（P＜0.01），SD 60 h后略有下降（P＜0.01），仍在2714±136.2 U／L的高水平（P＜0.01）（图2）。

图2 正常对照组与睡眠剥夺组AMS的变化。**示与对照组相比，P＜0.01，n＝48Fig.2 Changes of AMS level between control group and sleep deprivation groups.**P＜0.01 compared with the control group，n＝48

4.胰腺组织形态学改变

正常对照组小鼠胰岛细胞排列规则，胞质丰富；外分泌部腺泡细胞顶部富含酶原颗粒，胞核呈圆形位于基底部（图3A）。睡眠剥夺24 h组小鼠胰岛细胞排列不规则，部分细胞胞质减少；外分泌部细胞的酶原颗粒有所减少，出现部分空泡（图3B）。睡眠剥夺48 h组小鼠胰岛细胞排列紊乱，胞核固缩，胞浆减少，细胞间隙增大；外分泌部细胞胞浆内酶原颗粒释放，部分细胞呈空泡状（图3C）。睡眠剥夺60 h组小鼠胰岛部分细胞胞核消失，胞质浓缩，间隙明显扩大；外分泌部细胞排列紊乱，大部分细胞胞浆酶原颗粒消失呈空泡状 （图3D）。

图3 正常对照组与睡眠剥夺组胰腺的形态结构变化（HE 200×）。A，对照组；B，SD 24h组；C，SD 48h组；D，SD 60小时组。n＝12，红箭示胰岛细胞；黑箭示外分泌细胞Fig.3 Changes of morphological structure on pancreasbetween control group and sleep deprivation groups（HE 200×）.A.control group；B.SD 24 h；C.SD 48 h；D.SD 60 h.n＝12 Red arrows indicate the islet cells；Black arrows indicate the exocrine cells

5.胰腺免疫组织化学结果

TNF-α阳性产物呈棕黄色，主要分布在胞浆。正常对照组小鼠胰腺组织中未见 TNF-α表达（图 4A）；SD 24 h组 TNF-α的表达主要集中在胰岛，其外分泌部细胞胞浆内TNF-α染色较浅淡（图4B）。随着睡眠剥夺时间的延长，TNF-α在胰腺组织中胰岛和外分泌部细胞的棕黄色染色明显加深（图4C和4D）。

6.Western Blot法检测胰腺组织 TNF-α表达情况

正常对照组未见 TNF-α阳性条带。睡眠剥夺24 h、48 h、60 h后均可见大小约为35KDa的TNF-α阳性条带（图5A）。TNF-α的表达水平在SD 24 h明显升高（P＜0.01），在SD 48 h达到峰值（P＜0.01），至 SD 60 h稍有降低，但表达仍在较高水平（P＜0.01）（图5B）。

图4 正常对照组与睡眠剥夺组胰腺组织 TNF-α表达情况（200×）。A，对照组；B，SD 24h组；C，SD 48h组；D，SD 60小时组。n＝12，蓝箭示胰岛细胞；黑箭示外分泌细胞Fig.4 Expression of TNF-α in pancreas between control group and sleep deprivation groups（200×）.A.control group；B.SD 24 h；C.SD 48 h；D.SD 60 h.n＝12 Blue arrows indicate the islet cells；Black arrows indicate the exocrine cells

图5 正常对照组与睡眠剥夺组胰腺组织 TNF-α表达变化。**示与对照组相比，P＜0.01，n＝24Fig.5 Changedexpression of TNF-α in pancreas between control group and sleep deprivation groups.**P＜0.01 compared with the control group n＝24

讨 论

现代社会因工作或疾病导致人们被动的发生睡眠剥夺的现象越来越普遍，而睡眠剥夺对人体免疫力、内分泌、心血管等系统均可造成严重影响［10］。机体在睡眠剥夺后处于高代谢状态，能量消耗增加，出现进食增多及体重下降等表现［2，10］。本研究发现，睡眠剥夺后小鼠精神萎靡，毛发蓬乱无光泽，活动减少；同时体重明显减轻，SD 24 h、SD 48 h、SD 60 h体重较正常对照组分别下降了14.3%，31.2%，48.3%，提示本研究的睡眠剥夺模型诱导了能量代谢异常。

研究表明，睡眠剥夺引起的能量代谢异常可产生大量的活性氧族，导致氧化应激［11］。氧化应激可诱导小鼠胰腺组织中未折叠蛋白的过度表达，抑制胰岛素的分泌从而升高血糖［12］，但却缺乏形态学的证据以及外分泌部细胞结构和功能的改变。本项研究发现，睡眠剥夺 24 h、48 h、60 h后小鼠血清AMS含量较正常对照组显著升高，这与 HE染色所见外分泌部腺泡细胞酶原颗粒消失、细胞空泡化的病理改变有关；同时，胰岛细胞出现排列紊乱、胞质浓缩、细胞间隙扩大等形态学改变也解释了胰岛素分泌减少的原因。

胰腺结构和功能的损伤与氧化应激密切相关。氧化应激水平的增加促使 TNF-α的产生与胰腺病理损伤程度一致，从而成为衡量胰腺损伤的重要指标［13，14］。这与睡眠剥夺后机体的抗氧化防御能力降低、前炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的平衡失调有关，从而促使炎症反应的发生。本项研究中，正常对照组的胰腺组织未见TNF-α表达，而在SD 24 h后 TNF-α的表达量明显升高，并随睡眠剥夺时间延长在48 h达到峰值，并维持高位水平至60 h，提示炎症反应的发生。免疫组化结果显示，TNF-α阳性染色分布在胰岛细胞和外分泌部腺泡细胞胞浆中，并且胰岛细胞的染色更深，提示睡眠剥夺可能影响胰岛素的合成与分泌，进而干扰机体的能量代谢，引发全身多系统的氧化应激。

综上所述，睡眠剥夺后能量代谢的异常诱导氧化应激发生，进而促使胰腺中炎症因子 TNF-α大量表达，引起胰腺的炎症反应，造成胰腺细胞形态和功能损伤，其具体的分子机制有待于进一步研究。

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Sleep deprivation up-regulates expression of tumor necrosis factor alpha in mouse pancreas

Liu Lijun1，2，He Fei1，2，Guo Pei1，2，Wang Qi1，2，Wang Hongkai1，2，Ran Jianhua1，2*
（1Department of Anatomy，College of Medicine；2Neuroscience Research Center，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

Objective To investigate the impact of sleep deprivation on morphology and function of pancreas in mice and the pathological significance of expression of tumor necrosis factor-α（TNF-α）.Methods C57 mice were randomly divided into four groups：control group，and groups with sleep deprivation for 24 h，48 h，60 h，respectively.The mice subjected to sleep deprivation were observed for the general state and changes of body weight；serum amylase（AMS）level was detected.Sectioned Pancreatic slices were observed by H＆E staining and immunohistochemical staining to test the histological changes and the expression of TNF-α.Western Blot assay was practiced to detect the expression of TNF-αin the pancreas.Results With the extension of time，the body weight of sleep deprived mice was significantly decreased compared with that of the control group.AMS levels in sleep deprived mice significantly increased at 24 h，reaching the peak at 48 h which lasted till 60 h.H＆E staining demonstrated that mice deprived of sleep showed turbid pancreatic islet cells，with cytoplast pyknosis，expansion of interstitial tissue，disappearance of zymogen granules and vacuolization of acinar cells.Immunohistochemistry and Western blot showed that the sleep deprivation groups had increasingly higher expression of TNF-αin the pancreas with the extension of deprivation.Conclusion Sleep deprivation causes systemic failure in mice，and activates TNF-α-induced inflammation of the pancreas，leading to its morphological and functional damage.

Sleep deprivation；Pancreas；TNF-α

R364.5

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.018

2015-06-05

2015-08-22

国家自然科学基金（30500171）；重庆市教委项目（KJ120330）；重 庆 市渝 中 区科 委 项目（20120202）。重庆医科大学大学生科学研究与创新实验项目（201403），国家（市）级大学生创新创业训练计划项目（201410631003）

刘丽君，女（1988年）汉族，研究生

*通讯作者（To whom correspondence should be addressed）：

1315038024＠qq.com