温热抑制人胃癌 SGC790l细胞增殖、迁移

肖 凤刘 彬 余海红

（井冈山大学医学院，吉安 343009）

温热抑制人胃癌 SGC790l细胞增殖、迁移

肖 凤*刘 彬 余海红

（井冈山大学医学院，吉安 343009）

目的 探讨温热对人胃癌 SGC790l细胞增殖、迁移的影响。方法 对照组常温（37℃）下培养人胃癌 SGC790l细胞，实验组43℃水浴加热0.5h、1h、2h、3h后培养24h，采用倒置显微镜观察胃癌细胞的形态结构变化；Hoechst-33258荧光染色观察细胞核的变化；四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测细胞增殖抑制；细胞划痕愈合实验观察温热对胃癌细胞的运动迁移能力的影响；体外细胞侵袭实验（Transwell实验）观察温热对胃癌细胞侵袭能力的影响。结果 温热后细胞明显皱缩、变圆及细胞漂浮，3h大部分细胞漂浮；荧光染色显示温热后部分细胞核内出现浓染致密的颗粒块状荧光，胞核固缩、染色质高度凝聚和碎裂；MTT实验提示温热可明显抑制 SGC790l细胞生长；细胞划痕实验发现SGC790l细胞温热 1h、2 h后细胞迁移距离均明显小于对照组，温热3h后细胞基本未发生迁移；Transwell实验提示 SGC790l细胞温热后细胞侵袭能力明显下降。结论 温热对胃癌 SGC790l细胞具有明显的杀伤作用，温热可明显抑制胃癌 SGC790l细胞增殖和侵袭迁移能力。

胃癌；SGC790l细胞；温热；细胞迁移；细胞侵袭

肿瘤热疗（Hyperthermia）是继手术、放射治疗、化学治疗和生物治疗之后的第五大肿瘤治疗手段，其在肿瘤综合治疗中的地位及意义受到越来越多的关注。研究表明，43℃左右的温热治疗胃癌这类空腔脏器肿瘤效果较为确切，但其机制要比高热直接杀伤实质性脏器肿瘤细胞复杂得多。在胃癌热疗方面，相关的研究报道很少，且与临床实际条件不一致［1，2］。为此我们采用临床有效且相对安全的 43℃作为温热的条件，在体外观察温热对胃癌细胞生物学行为的影响，为临床应用提供理论基础。

材料和方法

1.材料

人胃癌细胞株 SGC7901细胞由江西省消化系疾病研究所馈赠。0.25%胰蛋白酶、高糖 DMEM培养液（美国GIBCO公司）；DMSO（美国 Amresco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）四甲基偶氮唑盐（MTT，美国 Amresco公司）；Hochest33258荧光染料（美国Sigma公司）；MATRIGEL MATRIX（香港BD公司）；纤维连接蛋白（郑州德福恩生物技术有限公司）；BSA（上海江莱生物科技有限公司）；抗荧光淬灭封片液（南京碧云天试剂公司）。

2.方法

2.1 细胞培养

用含10%胎牛血清的DMEM培养液常规培养（37℃、5%CO2饱和湿度），取对数生长期的细胞进行加热处理。

2.2 加热实验

实验组加热温度设置 43℃，根据加热时间不同分为43℃0.5h、1 h、2h及3h等亚组。将处于对数生长期内的 SGC7901细胞常规消化、离心、重悬混匀，计数后，接种于 35mm NEST培养皿，置 37℃、5% CO2恒温孵育箱培养至贴壁。用封口膜封口后放入43℃的电热恒温水浴箱加热（温度波动 ＜±0.1℃）。确保整瓶细胞平放淹没于水中，将温热处理后的细胞换新鲜的10%FBS-高糖DMEM培养液，并放置37℃、5%CO2恒温孵育箱继续培养24h。

对照组用封口膜封口后放入 37℃的水浴箱 3h后换新鲜的10%FBS-高糖DMEM培养液，并放置37℃、5%CO2恒温孵育箱继续培养24h。

2.3 细胞抑制率的 MTT法测定

非温热处理组作为常温对照，同时设不加细胞的背景对照，取温热处理后培养24h的各组细胞于倒置显微镜下观察细胞生长情况和形态变化。然后用0.25%的胰蛋白酶消化离心，用培养液重悬细胞计数，稀释成 1×104／ml，按每孔 200μl接种到 96孔培养板中，每组设6个复孔。再将每孔加入 MTT溶液20μl，避光条件下继续培养4h，终止培养，小心吸弃孔内培养基上清液，每孔加入 150μl DMSO，振荡10min，用酶联免疫检测仪测定每孔的光密度（OD）值，波长为570nm。根据各组测得的OD值计算各温热处理组 SGC7901细胞增殖抑制率，计算公式如下：

细胞增殖抑制率 ＝［1－实验组 OD值／对照组OD值］×100%

2.4 细胞核的 Hoechst-33258荧光染色

温热处理后培养24h的各组细胞，用4%多聚甲醛室温固定10min，加入 Hoechst 33258染色液，避光室温10min，用抗荧光淬灭封片液封片。实验重复3次。荧光显微镜观察细胞形态结构及胞核的变化并拍照。

结果评判标准：正常细胞胞核为 Hoechst（HO）蓝色淡染，浓染或成颗粒状为阳性，HO（－）为活细胞，HO（＋）为凋亡细胞。

2.5 细胞运动迁移能力的细胞划痕愈合实验检测

将对数生长期的 SGC7901细胞1×106个／ml接种于6孔培养板中，于 37℃，5%CO2恒温孵育箱中继续培养至上述细胞相互融合时，用 20μl枪头垂直于皿底在单层细胞上划痕，造成培养细胞伤口模型，划痕后用不含血清DMEM培养液轻柔漂洗 3次，再加入含10%FBS的 DMEM培养基分别予43℃温热处理0.5h、1h、2h及 3h，非温热处理组作为对照组，然后用不含血清 DMEM培养液轻柔漂洗3次，加入无血清培养基，放入37℃，5%CO2恒温孵育箱中，按0h，6h，12h，24h及48h后置于倒置显微镜下观察并拍照。并用ImageTool图像分析软件分析各温热时间组的细胞运动迁移情况。

2.6 细胞侵袭能力的体外侵袭实验检测

用 DMEM稀释 Matrigel胶至 5mg／mL，每孔取100μl包被 Transwell小室底部膜的上室面，用 5mg／mL纤维连接蛋白（fibroneetin，FN）10μl均匀涂在小室的下表面；每孔加入50μl含10g／L BSA的无血清培养基 37℃，30min；分别取对照组和各温热时间组（0.5h、1h、2h及3h）的胃癌 SGC7901细胞常规继续培养24h。0.25%EDTA胰酶消化细胞，用含10g／L BSA的 无 血 清 培养 基 重 悬，调 整 细胞 密 度 值5×105／ml；取细胞悬液 200μl加入 Transwell上室，每组设置3个复孔。Transwell下室中加入 500μl含10%FBS的培养基，将经上述处理后的24孔板常规继续培养24h后，用湿棉签擦去膜上面细胞，0.1%结晶紫染色后将小室置于倒置显微镜下观察穿过膜的细胞并计数。每个样本计数7个视野，取平均值。

2.7 统计学分析

应用 SPSS13.0统计软件行统计分析，数据均采用均数 ±标准差表示（（±s）），以单因素方差分析（one－way ANOVE）计算多组间差异，两两比较采用q检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

1.温热使胃癌细胞皱缩、变圆、漂浮

倒置显微镜观察：与对照组相比，温热0.5h部分贴壁SGC7901细胞出现皱缩，从胞膜伸出胞外的伪足逐渐减少，细胞逐渐变圆，细胞内颗粒成分逐渐增多，细胞漂浮，1h相对较少，2h细胞皱缩、变圆、漂浮明显增多，3h大部分细胞出现漂浮现象，温热0.5h、1h、2h和3h可明显损伤胃癌SGC7901细胞（图1）。

图1 不同时间温热处理 SGC7901细胞的形态变化（400×）Fig.1 Morphological changes of SGC7901 cells in various time thermotherapy group（400×）

2.温热抑制胃癌细胞增殖

根据 MTT实验原理，测量OD值可间接测量活细胞数量和其代谢活力。MTT结果显示：温热后，SGC790l细胞增殖抑制率逐渐升高，至3h最高，温热处理0.5h、1h、2h、3h后SGC790l细胞增殖抑制率分别为（32.7±2.3）%、（30.6±1.9）%、（43.8±3.4）%、（52.9±2.8）%，提示温热可明显抑制胃癌细胞。

3.温热使细胞核核浓缩和碎裂

对照组（0h）SGC790l细胞绝大数胞核呈弥散均匀的荧光，个别细胞核呈浓染致密的颗粒块状荧光，而实验组（温热0.5h、1h、2h和3h）更多细胞的细胞核内出现浓染致密的颗粒块状荧光，并显示出胞核固缩、染色质高度凝聚和碎裂，并且温热 0.5h就有较多细胞核出现核浓缩和碎裂，2h明显增多，3h最严重（图2）。

图2 不同时间温热处理对 SGC7901细胞核影响的 Hoechst-33258染色检测（400×）Fig.2 Nuclear change of SGC790l cells in various thermotherapy time by Hoechst-33258 fluorescent staining（400×）

4.温热使细胞运动迁移能力下降

细胞划痕愈合实验可检测细胞自身的运动迁移能力的强弱。我们采用此实验比较各温热组的各时间点 SGC790l细胞的运动迁移能力情况。结果显示划痕 24h后，由于细胞迁移，温热 1h组和 2 h组SGC790l细胞的划痕均有不同程度的“愈合”，对照组（温热0h）划痕愈合明显；划痕48h后温热1h组中度愈合，2h组轻度愈合，并且后者出现部分细胞漂浮，3h组细胞基本未发生迁移，对照组48h后基本愈合（表1，图3）。与对照组比较，温热1h组的细胞体外迁移能力明显下降（P＜0.05），温热2h组的细胞体外迁移能力下降更甚（P＜0.01），提示温热可显著抑制 SGC790l细胞的体外迁移能力。

5.温热对细胞侵袭能力的影响

体外侵袭实验可反映肿瘤细胞侵袭能力的强弱。本实验结果显示，SGC790l细胞温热后 3h细胞侵袭能力下降最明显，温热0.5h、1h、2h、3h后，每个视野中SGC790l细胞穿过 Matrigel胶到达 Transwell小室膜背面的细胞数明显减少，与对照组比较，均有显著差异（P＜0.05）（表2，图4A、4B）。结果表明：温热可显著抑制 SGC790l细胞侵袭能力。

图3 温热处理对 SGC791细胞愈合能力的影响（100×）Fig.3 Wound healing ability of SGC7901 cells in various time thermotherapy group（100×）.A0，B0，C0，D0，E0：the wound healing ability of control group after 0h，6h，12h，24h and 48h，and A1，B1，C1，D1，E1：the wound healing ability of thermotherapy 1h group after 0h，6h，12h，24h and 48h，and A2，B2，C2，D2，E2：the wound healing ability of thermotherapy 2h group after 0h，6h，12h，24h and 48h

图4 温热处理对 SGC7901细胞侵袭能力的影响（400×）Fig.4 Cell invasion change of SGC7901 cells in various time thermotherapy group（400×）.A-E，crystal violet staining；F，Average amount of invaded cells in various time thermotherapy group

讨 论

肿瘤热疗是一种以非电离辐射方式作用于肿瘤的物理治疗方法，其最大优势是毒副作用小，并能够多次重复使用，且可增强放射治疗和化学药物治疗的效果，目前在肿瘤综合治疗中备受关注［3］。一些肿瘤的体外研究发现，温热处理可杀伤肿瘤细胞。但不同类型的肿瘤细胞对热疗的反应和敏感性也存在明显差异。卞春安等［4］报道43℃热处理 15min或30min即可明显抑制肺癌 A549细胞增殖，杀伤 A549细胞；汤睿等［5］报道 43℃热处理 2 h可直接杀伤胃癌 SNU-1细胞；Brehmer的研究证实较温和的热疗引起前列腺癌细胞凋亡，较强的热疗则引起前列腺癌细胞坏死［6］。为此，我们选择了温热（43℃）分别处理 0.5h、1h、2h及3h，以期探讨温热对胃癌 SGC7901细胞生物学行为的影响。本研究 MTT结果显示，热疗0.5h、1h、2h和3h均引起 SGC790l细胞增殖明显受到抑制，3h细胞活力降为最低。

热疗对细胞杀伤作用的最突出证据就是细胞核仁和膜结构变化［7］。本实验倒置显微镜观察到温热后 SGC7901细胞体积变小变圆，核膜皱缩，核染色质凝聚和碎裂，3h大部分细胞漂浮。Hoechst-33258荧光染色结果显示，温热0.5h就较多细胞核呈浓缩颗粒块状荧光，2h明显增多且出现核碎裂，3h最严重。从形态学角度证实了温热具有明显损伤胃癌细胞的作用。

肿瘤细胞的侵袭与迁移是恶性肿瘤的主要生物学特征，也是影响患者预后的主要因素。有研究表明，温热能使贴壁肿瘤细胞表面的整合素等粘附分子表达降低［8］，抑制粘着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）的活性，从而抑制 FAK-Ras-MAPK信号通路介导细胞黏附和迁移。温热能降低uPA表达，减弱蛋白水解从而抑制肿瘤细胞的浸润和转移［9］。也能抑制有关 MMP的活性，增加 TIMP的释放，降低细胞侵袭能力［10］。我们在研究温热对胃癌细胞形态结构和增殖影响的基础上，检测温热后胃癌SGC7901细胞运动迁移和侵袭能力情况。本实验证实温热能够显著降低 SGC7901细胞的运动迁移和侵袭能力，为温热临床应用提供理论依据。而温热降低 SGC7901细胞的运动迁移和侵袭能力的具体机制还有待于深入研究。

［1］杨耀琴，陈斌，陶惠红，等.吐温 80合并温热诱导 BGC-823胃癌细胞凋亡及对 Hsp70，Bcl-2和 Bax表达的影响.中国组织化学与细胞化学杂志，2002；11（2）：306-309

［2］陈卫星，顾竹影，厉有名.加热诱导人胃癌细胞株MKN28凋亡的动力学研究.实用癌症杂志，2001；16（1）：126-128

［3］Lin TC，Lin FH，Lin JC.In vitro feasibility study of the use of a magnetic electrospun chitosan nanofiber composite for hyperthermia treatment of tumor cells.Acta Biomater.2012 Jul；8（7）：2704-2711

［4］卞春安，严煜，蒋琰华.加热对肺癌A549细胞生长和细胞周期影响的实验研究.中华肿瘤防治杂志2010，17（10）：732-735

［5］汤睿，朱正纲，瞿颖等.温热体外对人胃癌细胞株生物学行为的影响.世界华人消化杂志，2006，14（2）：144-150

［6］Brehmer M.Morphological changes in prostatic adenomas after transurethral microwave theromotherapy.Br J Urol，1997，80（1）：123

［7］Tronov VA，Konstantinov EM，Kramarenko II.Hyperthermia induced signal for apoptosis and pathways of its transduction in the cell.Tsitologiia.2002；44（11）：1079-1088

［8］Luchetti F，Mannello F，Canonico B，etal.Integrin and cytoskeleton behaviour in human neuroblastoma cells during hyperthermia-related apoptosis.Apoptosis 2004，9（4）：635-648

［9］Liang X，Xiao G，Mao Z.The effect of heat shock on the expression of urokinase-type plasminogen activator in human tongue squamous cell carcinoma cell line（Tca8113）.Huaxi Kouqiang Yixue Zazhi 2003，21（1）：150-152

［10］Sawaji Y，Sato T，Takeuchi A，etal.Antiangiogenic action of hyperthermia by suppressing gene expression and production of tumour-derived vascular endothelial growth factor in vivo and in vitro.Br J Cancer 2002，86（11）：1597-1603

Inhibition of proliferation and migration by hyperthermia in the human gastric cancer cell line SGC7901

Xiao Feng*，Liu Bin，Yu Haihong
（Department of Pathology，Medical School，Jinggangshan University，Ji'an 343000，China）

Objective To investigate the effect of hyperthermia on proliferation and migration of the human gastric cancer cell line SGC7901.Methods Human gastric cancer MKN45 cells were resuscitated and cultured in vitro.Following thermotherapy at 43℃for 0，0.5，1，2 or 3h，human gastric cancer SGC7901 cells were further cultured for 24 h.Their morphology was observed by inverted microscopy.Nuclear analysis was evaluated by Hoechst-33258 fluorescent staining.Cell proliferation was determined by MTT.Cell migration and cell invasion were evaluated by wound healing assay and transwell assay.Results Inverted microscopy revealed shrinked，rounded and floated SGC7901 cells，and Hoechst-33258 fluorescent staining demonstrated that there were nuclear condensation and fragmentation after thermotherapy.MTT assay showed that the growth of SGC7901 cells was inhibited.Cell migration was obviously reduced compared to that of the controls.No obvious migration was detected at 3 h of treatment.Invasion of SGC790l cells was reduced significantly.Conclusions Thermotherapy has a destructive effect on GC7901 cells，and significantly inhibits their proliferation，migration and invasion.

Gastric cancer；SGC7901 Cell Hyperthermia；Cell migration；Cell invasion

R735.2

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.010

2013-08-01

2013-08-15

江西省自然科学基金（20114BAB204025）

肖凤，女（1965年），汉族，教授

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）：164949497＠qq.com