生殖细胞及体细胞相关标记蛋白在小鼠胚胎雌雄生殖嵴的表达差异研究

沈 聪 郑 波 隋雪松 霍 然

（南京医科大学组织胚胎学系，江苏210029）

原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）是卵细胞和生精细胞的前体细胞。在小鼠胚胎6.25dpc（days postcoitum，交配后天数），PGCs由体细胞特化而来并不断进行有丝分裂和细胞迁移［1］。小鼠胚胎7.0－7.5dpc，PGCs定位于后肠，7.5－8.5 dpc后肠开始内陷折叠，PGCs进入胚内中胚层，细胞全能型标记物：Oct4，Sox2和 Nanog逐渐在PGCs中表达［2，3］。从8.5dpc开始，大量的 PGCs沿着胚芽的中线从后肠上皮开始迁移，于胚胎10－11dpc时迁移到达由脏壁中胚层形成的生殖嵴后不再发生迁移［4，5］。

当PGCs迁移到生殖嵴，周围的体细胞微环境使得生殖细胞分化为卵原细胞或精原细胞。生殖嵴中雌雄PGCs分化的标志是雌性PGCs进入减数分裂和雄性PGCs有丝分裂阻滞［5，6］，雌性生殖细胞在胚胎第13.5dpc启动第一次减数分裂并大约在胚胎第17.5dpc阻滞在网线期，而雄性生殖细胞进入有丝分裂阻滞，直到出生后才重新恢复有丝分裂。

研究显示，体细胞在PGCs的发育，功能的完善起到重要作用［5，6］。在性别决定后，雄性生殖嵴的体细胞，主要是支持细胞，表达SOX9，AMH（Muellerian－inhibiting factor）等使得生殖嵴往雄性方向发育，形成睾丸索结构，进而为生殖细胞发育提供微环境，保证其进入有丝分裂阻滞［5，7］。对于雌性生殖嵴而言，体细胞表达FOXL2（主要是颗粒细胞），由于分泌视黄酸（Retinoic acid，RA）并且无法像支持细胞样表达 CYP26B1（cytochrome P450，family 26，subfamily b，polypeptide 1）降解RA而导致雌性生殖细胞内 STRA8（Stimulated by retinoic acid gene 8protein）表达，从而启动减数分裂［5，6］。小鼠卵原细胞在13.5dpc进入减数分裂，称为卵母细胞。约在16.5dpc时，扁平的颗粒细胞包围正在发生减数分裂的卵母细胞合胞体，形成cysts（包囊）。从17.5dpc－0dpp（days postpartum，出生后天数），卵母细胞合胞体细胞质开始分裂，颗粒细胞开始侵入cysts，最终形成原始卵泡，这一过程称为cysts解聚（cysts breakdown）［8］。

基因敲除模型已经证明，敲除雌性生殖嵴颗粒细胞特异的标记蛋白，如Foxl2，Gdf9等基因会导致原始卵泡发育的异常［9，10］。在早期的生殖嵴发育过程中，许多重要的功能基因已经被人们阐述，如DDX4、OCT4、FOXL2、SOX9［2，3，7］。但对雌雄生殖嵴发育过程中生殖细胞及体细胞的表达差异仍缺乏系统研究，本研究通过免疫荧光技术分别在雌、雄12.5、13.5、14.5、18.5dpc及1dpp生殖嵴标记 DDX4、OCT4、GATA 4、FOXL2、SOX9、γ－H2AX及P－RB1系统的探讨不同细胞组分功能蛋白的特异性表达模式及其对于早期胚胎生殖嵴的发育和分化的重要作用。

材料和方法

1.实验动物

CD1小鼠购自南京医科大学动物实验中心，所有动物实验得到南京医科大学动物伦理委员会授权通过。饲养的环境维持在20℃－22℃，12h／12h昼夜周期，50%－70%湿度的环境下。交配后次日上午阴道见栓记为0.5d。收集早期胚胎第12.5、13.5、14.5、18.5dpc和1dpp小鼠的雌雄生殖嵴。

2.试剂、仪器

抗DDX4鼠抗购自Abcam公司ab27591，抗DDX4兔抗购自Abcam公司ab13840，抗OCT4购自Santa Cruz公司sc－8628，抗 GATA4购自Santa Cruz公司sc－1237，抗SOX9购自millipore公司的AB5535，抗 FOXL2购自 Novus Biologicals公司Nb100－1277，抗 γ－H2AX 购 自 Abcam 公 司 的ab26350，Alexa Fluor系列的荧光二抗购于美国invitrogen公司；DAPI购自Sigma公司；德国Leica公司生产的RM2235切片机；德国蔡司公司生产的LSM510激光共聚焦显微镜。

3.样本制备

分别取早期胚胎12.5、13.5、14.5、18.5dpc及1dpp雌雄生殖嵴组织，经4% 多聚甲醛固定过夜，经50%、70%、80%、90%、100%梯度酒精脱水，常规石蜡包埋。切片厚度为5μm，65℃温箱烤干过夜后室温保存。

4.免疫荧光染色

组织经100%、90%、80%、70%梯度酒精脱蜡后采用柠檬酸（pH6.0）抗原修复。1%BSA室温封闭2h后加一抗，其中DDX4稀释比例1∶500，OCT4稀释比例1∶500，GATA 4稀释比例1∶100，SOX9稀释比例1∶500，FOXL2稀释比例1∶200，γ－H2AX稀释比例1∶500，加完一抗4℃过夜。次日经PBS洗涤后加荧光标记的二抗（1∶500）室温孵育2h。经DAPI染核5min后甘油封片，避光保存，尽早拍照。

结 果

1.DDX4，OCT4在胚胎雌雄生殖嵴的表达模式

我们首先用DDX4的抗体标记早期胚胎雌雄生殖嵴中所有生殖细胞以及用OCT4标记雌雄生殖嵴中具有干性的生殖细胞［11，12］。如图所示，DDX4在12.5、13.5、14.5、18.5dpc以及1dpp的雌、雄生殖嵴的生殖细胞胞质中均呈现持续的表达。OCT4在雄性生殖嵴各时间点也均有表达，但是在18.5dpc和1dpp表达量明显下降；OCT4在雌性生殖嵴12.5、13.5dpc有表达，但从14.5dpc及以后不表达（图1）。

图1 DDX4，OCT4在不同发育时间点（12.5、13.5、14.5、18.5dpc以及1dpp）雌性（A）和雄性（B）生殖嵴中表达模式。Bar：20μmFig.1The expression patterns of DDX4and OCT4from different time points（12.5、13.5、14.5、18.5dpc and 1dpp）between female（A）and male（B）embyos in mice.Bar：20μm

2.GATA4，FOXL2和SOX9在胚胎雌雄生殖嵴的表达模式

为了探讨体细胞相关功能蛋白的表达模式，我们首先选择了雄雌生殖嵴共有的体细胞标记蛋白GATA 4［13］。如图所示（图 2A、2B），在雌性生殖嵴 GATA 412.5至14.5dpc持续表达在体细胞，而在18.5dpc以及1dpp不表达；GATA 4在雄性生殖嵴从12.5dpc至1dpp持续表达在体细胞。FOXL2是雌性生殖嵴颗粒细胞特异表达的标记蛋白［7］，我们荧光结果观察到其在各阶段均有表达（图2C）。SOX9是雄性生殖嵴中支持细胞特异表达的标记蛋白［7］，如图所示（图2D），其在各时间点的支持细胞中均有表达。

图2 GATA4（A、B），FOXL2（C）和SOX9（D）不同发育时间点（12.5、13.5、14.5、18.5dpc以及1dpp）雌雄生殖嵴中表达模式。Bar：20μmFig.2The expression patterns of GATA4（A、B）、FOXL2（C）and SOX9（D）from different time points（12.5、13.5、14.5、18.5dpc and 1dpp）between female（A）and male（B）embyos in mice.Bar：20μm

3.γ－H2AX在胚胎雌性生殖嵴的表达模式

γ－H2AX是减数分裂前期的重要功能蛋白［14］，如图所示我们发现在雌性生殖嵴13.5dpc已经可以检测到其少量的表达，在14.5dpc可见γ－H2AX大量的表达，而在18.5dpc以及1dpp已经无法观察到其表达（图3）。

图3 γ－H2AX在雌性生殖嵴不同发育时间点（12.5、13.5、14.5、18.5dpc以及1dpp）表达模式。Bar：20μmFig.3The expression patterns ofγ－H2AX from different time points（12.5、13.5、14.5、18.5dpc and 1dpp）in female embyos in mice.Bar：20μm

4.P－RB1在胚胎雌雄生殖嵴的表达模式

P－RB1是RB1的失活形式，已有研究表明它在有丝分裂中主要功能是促进细胞周期G1－S转换并且类似的功能也在雄性生殖细胞中有研究［15，16］。如图所示我们观察到P－RB1在12.5dpc的雄性生殖嵴中有表达，但是从13.5dpc及以后失去表达。通过对雌性生殖嵴的染色，我们发现P－RB1从12.5 dpc至14.5dpc持续表达而在18.5dpc及1dpp时不再表达（图4）。

图4 P－RB1在不同发育时间点（12.5、13.5、14.5、18.5dpc和1dpp）雌性（A）和雄性（B）生殖嵴的表达模式。Bar：20μmFig.4The expression patterns of P－RB1from different timepoints（12.5、13.5、14.5、18.5dpc and 1dpp）between female（A）and male（B）embyos in mice.Bar：20μm

讨 论

PGCs是卵细胞和生精细胞的前体细胞。当PGCs到达生殖嵴，受体细胞微环境的影响发生向睾丸或卵巢分化的不同命运［5，6］。本研究通过对早期胚胎发育不同阶段生殖嵴特异的标记蛋白包括DDX4、OCT4、γ－H2AX的染色，系统地认识早期雌雄胚胎生殖嵴发育过程，其中DDX4作为生殖细胞特异的标记蛋白，定位在生殖细胞的细胞质［11］，OCT4作为生殖细胞全能性的标记蛋白，特异定位在未分化的生殖细胞即卵原细胞和精原细胞［12］，胚胎雌性生殖细胞第一次减数分裂的细线期会发生DNA双链断裂，细线期DNA双链断裂是减数分裂中重要事件，γ－H2AX是DNA双链断裂的标志，是减数分裂前期的重要功能蛋白［14］。我们的实验结果表明DDX4在12.5、13.5、14.5、18.5dpc以及1dpp的雌、雄生殖嵴均呈现持续的表达，OCT4在雄性性腺各时间点也均有表达，但在18.5dpc和1dpp表达量明显下降，提示生殖细胞全能性逐渐降低；OCT4在雌性生殖嵴12.5、13.5dpc有表达，与之前文献报导中CD1小鼠胚胎第13.5dpc雌雄生殖嵴OCT4荧光染色的结果一致［12］，但随着减数分裂的进行不再表达，本研究所用小鼠同样是CD1小鼠。荧光结果发现γ－H2AX在雌性生殖嵴13.5 dpc开始有少量表达，说明雌性生殖嵴从13.5dpc开始进入减数分裂。同样有文献报导CD1小鼠13.5、14.5dpc雌性生殖嵴γ－H2AX的表达情况［17］，文献中在13.5dpc没有观察到其表达，可能和小鼠交配的时间点以及小鼠的发育情况有关，但在14.5 dpcγ－H2AX的表达和我们荧光结果一致，说明此时大部分生殖细胞都进入减数分裂。

为了系统的观察雌雄生殖嵴发育过程中体细胞的重要作用，我们在本研究中分别选取雄性生殖嵴特有的体细胞标记蛋白（SOX9），SOX9特异表达于支持细胞并参与了雄性的性别分化［5，7］，雌性生殖嵴特有的体细胞标记蛋白（FOXL2），其特异的定位在颗粒细胞中［7］，以及两者共有的体细胞标记蛋白（GATA 4），通过对早期胚胎不同时间段的免疫染色观察到了体细胞动态变化的过程，其中SOX9在雄性生殖嵴在各时间点的支持细胞均有特异表达，FOXL2在雌性生殖嵴各时间点的颗粒细胞均有表达，GATA 4在雄性生殖嵴各时间点的体细胞中均有表达，在雌性生殖嵴的18.5dpc和1dpp中没有其表达。之前的文献报导CD1小鼠GATA 4定位在早期生殖嵴的体细胞中，随着性别分化，GATA 4在雄性生殖嵴中持续有表达，而GATA 4在雌性生殖嵴的表达逐渐减弱，在胚胎的晚期和新生的雌性小鼠中很少有其表达，直到成年后又恢复其表达，这与我们荧光的结果基本一致［13，18］。我们的研究结果一方面提示着性腺的发育和分化伴随着雌雄体细胞特有标记蛋白表达的性别差异；另一方面，雌雄共有的体细胞标记蛋白对于性腺的发育也是必不可少的。

通过对13.5dpc雌、雄性生殖嵴的免疫荧光染色，Spiller等发现P－RB1在雄性生殖细胞中已经不表达而在雌性生殖细胞中有表达［16］。该篇研究提示PRB1可以抑制生殖细胞有丝分裂阻滞以及促进减数分裂的进程。然而P－RB1是否可以参与减数分裂的阻滞目前尚无报道。本研究对胚胎雌雄生殖嵴12.5、13.5、14.5、18.5dpc及1dpp进行P－RB1的免疫荧光染色，再一次验证了在雄性13.5dpc开始已经不表达P－RB1，这与文献报导一致［16］，同时我们也发现在雌性12.5、13.5、14.5dpc均有P－RB1，但随着减数分裂的进程，当生殖细胞发生减数分裂阻滞时即胚胎18.5 dpc和1dpp已经不表达P－RB1，提示着P－RB1抑制生殖细胞有丝分裂阻滞的同时也可以抑制减数分裂阻滞。但是关于P－RB1在有丝分裂／减数分裂进程中具体的调控机制仍需进一步深入研究。

综上，本研究较系统的观察了早期胚胎雌雄生殖嵴发育过程中形态学的动态变化（主要是生殖细胞和体细胞的动态变化）和两个重要的生物学事件（减数分裂和有丝分裂阻滞）。为后续更加深入的研究生殖嵴发育、分化的分子机制提供了基础。

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