oHSV1－GFP法检测肝癌循环肿瘤细胞

阴丽媛 张 文 肖 汀 荣维淇 王 云 韩迺君邸雪冰 郭素萍 刘滨磊＊ 张开泰＊ 程书钧

（1北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院病因及癌变研究室；2中国医学科学院肿瘤医院免疫学研究室；3中国医学科学院肿瘤医院腹部外科，北京100021）

恶性肿瘤的复发和转移是肿瘤患者死亡的主要原因［1］。利用现代免疫学和分子生物学技术能够在肿瘤患者血液中检测到一种微转移细胞，称为循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）。CTC 为实体瘤或转移灶中的肿瘤细胞脱落进入到外周血液循环的具有转移倾向的肿瘤细胞［2］。临床研究发现，在结直肠癌、乳腺癌及前列腺癌等恶性肿瘤中，CTC计数可作为预后评估的独立预测指标，并对早期评估抗肿瘤疗效具有潜在价值［2－6］。目前富集CTC的方法主要有两大类：免疫磁性分离法和基于形态学富集法。采用上皮细胞粘附分子（EpCAM）、角蛋白（CK）等细胞表面分子标志物的抗体标记后再检测是目前应用最广泛的方法，如CellSearch系统。CellSearch系统是一项半自动检测系统，能够自动捕获实体瘤中脱落到循环血中的肿瘤细胞，对转移癌的诊断有较高的特异性，但由于EpCAM局限于上皮来源肿瘤细胞［7］，因此限制了CellSearch系统的CTC检测能力。另一方面肿瘤细胞在转移过程中可能会发生上皮间质转化［8］，EpCAM和CK表达下调，导致捕获率下降。基于形态学富集法利用CTC比外周血细胞体积大和硬度高的特点［9］，通过过滤富集后结合免疫细胞化学的方法进行检测，但是CTC的大小和变形性具有异质性，此类方法难有统一的检测流程和质控标准。

研究表明，80%的恶性肿瘤不同程度表达端粒酶［10，11］，正常情况下人类体细胞端粒酶的检测结果为阴性［12］。人类端粒酶主要由RNA成分（hTR）、端粒酶相关蛋白1（hTEP1）和催化亚单位（hTERT）三部分组成。hTEP1的mRNA表达并不限于有端粒酶活性的组织和细胞系，各组织的水平差异与端粒酶活性无关，因此，端粒酶活性并不是由TEP1决定，hTERT则是端粒酶活性所必需的核心组分。hTERT可识别单链富含G的寡核苷酸引物，以其RNA组分的碱基为模板与端粒重复序列进行碱基互补配对，在合成、延伸碱基序列中起催化作用［13］。利用hTERT启动子进行转录基因调控是目前抗肿瘤靶向研究中热点之一。oHSV1－GFP是一种经过基因修饰的人单纯疱疹病毒。我们将该病毒的复制关键基因ICP4的启动子替换为人端粒酶逆转录酶的启动子，并在ICP4下游连接GFP表达盒，以使该病毒在感染细胞后，能在端粒酶逆转录酶转录环境的作用下激活下游绿色荧光蛋白基因的表达。研究利用构建的病毒oHSV1－GFP特异性示踪循环血液中肿瘤细胞，通过荧光显微镜或流式细胞仪直接检测荧光信号对CTC进行计数。

材料和方法

1.病毒oHSV1－GFP的构建

研究利用基因修饰方法，将oHSV1的基因ICP34.5敲除，替换为GFP表达盒。病毒oHSV1－GFP由中国医学科学院免疫学教研室提供［14］。该病毒在感染细胞后，能在端粒酶逆转录酶转录环境的作用下激活下游绿色荧光蛋白基因的表达。

2.细胞培养

人非小细胞肺癌细胞系A549（ATCC，美国），人肝癌细胞系 HepG2（ATCC，美国），人结直肠癌细胞系SW480、HCT116（ATCC，美国），人胶质瘤细胞系 U251（WHO IV级 ATCC，美国）在含有10%胎牛血清的 RPMI－1640（Invitrogen，美国）完全培养基中置于5%CO2、37℃条件下培养。人胚肺成纤维细胞 WI－38（ATCC，美国）在含有1%非必需氨基酸，10%胎牛血清 MEM（Invitrogen，美国）完全培养基中置于5%CO2、37℃条件下培养。

3.细胞总蛋白提取和Western Blot分析

用含有1%苯甲基磺酰氟（PMSF）、1%蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液（普利莱，中国）提取细胞总蛋白。采用BCA Protein Assay Kit（Thermo，美国）进行蛋白定量后用于Western Blot分析。所用抗体为hTERT（1∶1000，药明康德，中国）。

4.临床标本收集

收集对象为中国医学科学院肿瘤医院腹部外科2013－2014年连续收治的原发性肝细胞肝癌患者。50例健康体检的正常人作为对照。

随机选取26例肝癌患者（Ⅰ－Ⅳ期）外周血4ml为血标本。随机选取7例肝癌患者（Ⅰ－Ⅱ期）手术切除的肿瘤组织为组织标本。

5.标本处理

用EDTA－K2抗凝采血管采集患者4ml外周血，红细胞裂解液（NH4Cl，0.15mol／L；EDTA，0.1mmol／L；KHCO3，10mmol／L；pH＝7.2）室温裂解5min，离心弃上清，PBS洗涤细胞后用无血清培养基重悬细胞，按照MOI＝1比例感染细胞，37℃，5%CO2孵育。24h后收集细胞，用200μl PE－Cy5标记的抗人CD45（BD，USA）抗体室温避光孵育30min，PBS洗涤细胞一次，之后用2ml PBS重悬细胞，流式细胞仪检测，CD45－／GFP＋的细胞为循环肿瘤细胞。

6.统计学分析

该方法的检出率分析使用软件SPSS 15.0中线性回归模型分析。

结 果

1.端粒酶逆转录酶在不同肿瘤细胞系、正常细胞及肿瘤组织中的表达情况

Western blot检测hTERT在肝癌细胞系SMMC7721、HepG2，结直肠癌细胞系 SW480、HCT116，胶质瘤细胞系 U251，肺腺癌细胞系A549，及正常细胞系WI－38中端粒酶的内源性表达量。结果显示正常细胞系WI－38中hTERT表达量很低（图1A），肿瘤细胞系中端粒酶均有表达，表达量明显高于正常细胞组。此外Western blot检测手术切除的肿瘤组织中的端粒酶逆转录酶表达量，结果显示在7例肝癌患者手术切除的肿瘤组织标本中hTERT表达量有差异，但均可检测到hTERT的表达（图1B）。

图1 hTERT在细胞系及肿瘤组织中的表达情况：A：Western Blot检测hTERT在 WI－38、SMMC7721，HepG2，SW480，HCT116，U251，A549细胞系中表达量，图中1－7依次代表 WI－38、SMMC7721，HepG2，SW480，HCT116，U251，A549细胞系；B：Western Blot检测hTERT在7例肝癌患者手术切除的肿瘤组织表达情况，图中1－7依次代表不同病例编号Fig.1Expression of hTERT in cell lines and tumor tissue.A.The expression of hTERT in cell lines－WI－38、SMMC7721，HepG2，SW480，HCT116，U251，A549；B The expression of hTERT in seven patients＇tissues of liver cancer was measured using Western blot analysis.

2.不同肿瘤细胞系感染oHSV1－GFP病毒后GFP表达情况

应用oHSV1－GFP病毒按照MOI＝1感染肿瘤细胞系A549、SMMC7721，分别在感染后0h，24h，应用倒置荧光显微镜观察。结果显示，该两株肿瘤细胞系在感染病毒后24h稳定表达绿色荧光蛋白。

图2 A549、SMMC7721感染病毒后荧光照相显示GFP表达情况：A：肺癌细胞系A549按照MOI＝1感染病毒24h后荧光图；B：肝癌细胞系SMMC7721按照MOI＝1感染病毒24h后荧光图。结果显示肿瘤细胞系在感染病毒24h后均可以稳定表达绿色荧光蛋白Fig.2The expression of GFP in A549and SMMC7721after HSV1－GFP infection.A Images of A549cells were recorded for 24hafter HSV1－GFP infection at an MOI of 1.B Images of SMMC7721cells were recorded for 24hafter HSV1－GFP infection at an MOI of 1.

3.oHSV1－GFP方法检出率测定

抽取2名正常志愿者外周血各4ml，将肿瘤细胞系 Huh7，SMMC－7721分别按10，50，100（个）加到外周血中，模拟循环肿瘤细胞。应用oHSV1－GFP方法检测外周血中CD45－／GFP＋细胞，结果显示外周血中加入SMMC7721细胞10，50，100个的检出数分别为6.8±2.04，40.8±4.04，85.9±7.03，线性回归模型分析得到总体检出率为87.9%，外周血中加入Huh7细胞10，50，100个的检出数分别为6.6±1.90，39.8±3.88，86.4±7.63，线性回归模型分析得到总体检出率为88.5%。回归分析显示CD45－／GFP＋细胞与循环肿瘤细胞模型中的肿瘤细胞数具有明显相关性，SMMC7721模型r2＝0.981，HuH7模型r2＝0.9779（图2）。

图3 肿瘤细胞系模拟循环肿瘤细胞检出率：A外周血中加入SMMC7721细胞10，50，100个的检出数分别为6.8±2.04，40.8±4.04，85.9±7.03B外周血中加入 Huh7细胞10，50，100个的检出数分别为6.6±1.90，39.8±3.88，86.4±7.63.线性模型回归分析显示CD45－／GFP＋细胞与循环肿瘤细胞模型中的肿瘤细胞数呈线性关系，总体检出率分别为87.9%、88.5%。Fig.3The recovery rate of SMMC7721and Huh7detection.A The recovery rate of SMMC7721simulated tumor modelwas showed.B The recovery rate ofHuh7simulated tumor model was showed.Regression analysis of the number of CD45－／GFP＋cells versus the number of spiked tumor cells showed good relevancy.

4.应用oHSV1－GFP方法检测肿瘤患者外周血标本中肿瘤细胞

临床收取26例原发性肝细胞肝癌患者（I－IV期）外周血，将26例样本按照区域淋巴结病理诊断阳性及阴性各分为两组，以及50例正常人外周血各4ml，用oHSV1－GFP方法进行标记后，流式细胞仪检测循环血液中CD45－／GFP＋细胞，并计数（图3），26例肝癌患者外周血中CD45－／GFP＋的细胞数（23.77±4.49个／4ml）明显高于正常健康人（0.94±0.12个／4ml），P＜0.0001，其中区域淋巴结阳性的患者外周血中循环肿瘤细胞计数（23.77±4.49）明显高于区域淋巴结（9.76±1.87）的患者，P＝0.0002。

图4 临床样本循环肿瘤细胞计数：收集50例正常人外周血及26例肝癌患者外周血4ml用oHSV1－GFP检测循环肿瘤细胞。肝癌患者外周血中CD45－／GFP＋的细胞数为23.77±4.49个／4ml，正常健康人外周血中 CD45－／GFP＋的细胞数为0.94±0.12个／4ml P＜0.0001，区域淋巴结阳性的患者外周血中循环肿瘤细胞计数（23.77±4.49）明显高于区域淋巴结阴性（9.76±1.87）的患者P＝0.0002。Fig.4The circulating tumor cells detection in clinical samples.The number of CD45－／GFP＋cells in hepatocellular carcinoma patients＇peripheral blood（23.77±4.49）is significantly higher than that of the healthy people（0.94±0.12）P＜0.0001.The number of CD45－／GFP＋ cells in regional lymph node positive patients＇peripheral blood（23.77±4.49）is significantly higher than that of regional lymph node negative patients（9.76±1.87），P＝0.0002.

讨 论

CTCs检测具有无创、简便、重复性好及临床应用潜力大等优点，越来越引起研究者的关注。然而CTCs在外周血中的含量极少，每10ml血液中可能仅含少数几个CTCs，准确检测到CTC非常困难［15］。目前的检测手段主要是基于肿瘤细胞表面的分子标志物如EpCAM，CK及白细胞表面分子标志物CD45，通过免疫磁珠进行富集，富集后的细胞在显微镜下观察计数［17］。然而播散的肿瘤细胞往往存在角蛋白（CK8，CK18，CK19）表达缺失［17－20］，细胞及细胞间粘附分子表达下调以及上皮间质转化等［20－21］，从而导致EpCAM 表达下调。鉴于此，此类方法检测CTCs存在一定的局限性。

研究新建立了一种新的溶瘤病毒特异性示踪肿瘤细胞的检测方法，结果显示该方法可以较为准确检测到CTCs。端粒酶活性与恶性肿瘤密切相关，细胞端粒酶活性因某些原因被激活，使端粒维持在一定长度，细胞因此成为无限增殖细胞。研究显示80%以上的肿瘤中可以检测到端粒酶［11］。该方法基于端粒酶的活性，示踪肿瘤细胞敏感性好，瘤谱广，有望成为一种有效的监测循环肿瘤细胞的方法。另一方面，该方法能够示踪具有生物活性的肿瘤细胞，这样大大减少了循环血中已凋亡［16，22］的肿瘤细胞的假阳性干扰，可以给临床提供更加准确的信息。此外，我们用该方法可以将标记的肿瘤细胞分选获得单个细胞，为后续测序或药敏实验研究以及更为深层的癌症转移的机制信息的获取提供了可能。总结本研究工作，我们开发了一种新颖便捷的CTC检测及捕获技术，其对癌细胞的检测的准确性已经得到实验证明。该技术检测方法简单、重复性好、价格便宜，在今后大规模临床应用具有极大的优势。当然，目前还只是初步研究，仍然需要今后的工作进一步完善研究如优化分选条件，从循环系统中捕获肿瘤细胞，应用基因组测序或表达谱芯片技术深入研究肿瘤发生转移的分子机制。

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