X盒子结合蛋白1对肾小管上皮细胞脂质代谢的影响研究

李宏博 朱 琳 赵 松 刘淑霞 赵 雪 郝 军＊

（1河北医科大学病理学教研室，石家庄050017；2河北医科大学第三医院肌电图室，石家庄050051）

内质网应激也被称作非折叠蛋白反应 （unfolded protein response，UPR），已被证实参与了糖尿病肾病的发生，内质网应激反应是一个复杂的过程，涉及了多种调控因子和通路［1］。其中，内质网跨膜激酶1／X 盒子结合蛋白－1（inositol requiring 1／X－box binding protein1，IRE1／XBP－1）是经典的内质网应激信号通路，当内质网应激发生时，该通路被激活，进一步避免细胞凋亡的发生［2］。XBP－1有两种状态：非拼接型和拼接型，其中拼接型XBP－1比非拼接型XBP－1有更强的转录活性，通过影响基因转录来调节相关的生理活性［3］。

近年来，有研究发现XBP－1除了参与内质网应激外，还具有调节肝脏脂质代谢的功能。在XBP－1敲除小鼠，影响肝脏脂质代谢，导致血清甘油三酯和胆固醇降低［4］。Nishina等人发现高表达丙型肝炎病毒蛋白的转基因小鼠，喂食过量含铁食物，导致固醇调节元件结合蛋白－1（sterol regulatory element binding protein－1，SREBP－1）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）、拼接型和非拼接型 XBP－1、磷酸化真核生物翻译起始因子2α（phosphorylated eukaryotic initiation factor－2alpha， p－eIF2α），CCAAT／增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT／enhancer－binding protein homology protein，CHOP）高表达以及细胞内大量自噬体。然而，抗氧化剂N乙酰半胱氨酸（N－acetyl cysteine，NAC）显著降低了转基因小鼠的拼接型和非拼接型 XBP－1、peIF2α、CHOP和肝脂肪变性［5］。肾脏脂质代谢异常被揭示参与了多种肾脏疾病，例如糖尿病肾病、狼疮性肾炎、原发性肾小球肾炎等。XBP－1是否是导致肾脏细胞出现脂质沉积的机制之一还未见报道。

因此，本研究使用人肾近端小管上皮细胞（human renal proximal tubular cell line，HKC），转染拼接型和非拼接型XBP－1质粒，48h后检测脂质代谢因子脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl－CoA carboxylase，ACC）和脂肪分化相关蛋白（adipose differentiation related protein，ADRP），以明确高表达的XBP－1对肾小管上皮细胞脂质代谢的影响。

材料和方法

1．试剂

油红O购自美国Sigma公司，脂质体2000、Trizol和逆转录试剂盒购自Invitrogen公司，兔抗XBP－1抗体购自Abcam公司，兔抗β－actin抗体购自Epitomics公司，PCR扩增试剂购自Promega公司。拼接 型 XBP－1 质 粒 （spliced XBP－1plasmid，XBP－1splasmid）和非拼接型XBP－1质粒（unspliced XBP－1plasmid，XBP－1μplasmid）由日本京都大学生物物理研究室的Kazutoshi Mori教授惠赠。

2．细胞

人肾小管上皮细胞株由301医院陈香美教授惠赠，细胞采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，细胞随机分为三组：未转染组、空质粒转染组（pcDNA3．1）、拼接型 XBP－1 质粒转染组（XBP－1s plasmid）和未拼接型 XBP－1质粒转染组（XBP－1μ plasmid）。

3．方法

3．1瞬时转染

瞬时转染采用脂质体2000，HKC细胞培养于6孔板内，待细胞生长至约90%时，进行转染。4．0μg载体DNA和10μl脂质体2000分别溶解于250μl无血清DMEM培养基内，混合，室温放置20min后加入6孔板内。5h后更换全血培养基，48h后进行相关检测。

3．2免疫印迹

从HKC细胞提取总蛋白，经10%SDS－PAGE凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜，含5%BSA的TTBS 37℃孵育1h，一抗4℃孵育过夜，XBP－1（1∶500）、β－actin（1∶1000）。PVDF膜用TTBS清洗3次，每次10min，二抗（1∶5000）室温孵育2 h，TTBS洗膜3次后，加ECL发光液孵育1min，红外线凝胶成像仪检测，图像分析采用IPP5．0，以目的基因与β－actin条带的IOD比值作为最终结果。

3．3逆转录PCR

细胞用PBS洗涤2次，尽量将液体吸干，加入Trizol 1ml裂解细胞进行RNA提取，选择波长260nm测RNA总浓度，A260／A280在1．8－2．0之间。在逆转录酶（MLV）催化下合成cDNA，以适量cDNA为模板在TaqDNA聚合酶催化下进行PCR扩增，所用引物均由Invitrogen公司合成（见Tab．1）。扩增条件为：预变性94℃5min，进入循环，94℃50s，55℃50s，72℃50s，30个循环后72℃8min。将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，置于凝胶图像分析系统，用LabWorks 4．5软件进行积分光密度值（integrated optical density，IOD）测定，以管家基因GAPDH作为内参照校正，用目的基因的积分光密度值与GAPDH积分光密度值的比值代表目的基因的相对表达含量。

表1 FASN，ACC和GAPDH引物和扩增片段Table 1 Primers and product for FASN，ACC and GAPDH

3．4免疫细胞化学

HKC细胞培养于盖玻片，终止培养后，10%中性福尔马林固定15min，0．3% 曲拉通X－100 37℃孵育20min，山羊血清37℃封闭30min，抗ADRP一抗（1∶100）4℃孵育过夜，PBS洗3次，每次5min，生物素化的二抗37℃孵育30min，PBS洗3次，每次5min，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素37℃孵育30min，PBS洗3次，每次5min，DAB显色。以PBS代替一抗做阴性对照。

3．5油红O染色

HKC细胞培养于盖玻片上，终止培养后，10%中性福尔马林固定15min，油红O染液染色15 min，玻片70%酒精中浸泡5s以去除背景着色。苏木素复染，自来水冲洗干净，晾干后甘油明胶封片。

4．统计学分析

所有数据以均数± 标准差表示，采用SPSS 13．0统计学软件进行分析，均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用Student－Newman－Keuls法，P＜0．05被认为有统计学意义。

结 果

1．拼接型和非拼接型XBP－1质粒转染HKC细胞上调XBP－1表达

拼接型XBP－1质粒转染HKC细胞48h后，拼接型XBP－1（分子量为54kDa）明显升高，分别为空白对照组和空质粒转染组的3．73倍和3．72倍，但对非拼接型XBP－1（分子量为33kDa）的表达未产生明显影响。相似地，非拼接型XBP－1质粒上调了HKC细胞非拼接型XBP－1蛋白的表达，对拼接型XBP－1未见影响（Fig．1）。

图1 拼接型和非拼接型XBP－1质粒上调HKC细胞XBP－1蛋白表达Fig．1The spliced XBP－1plasmid and unspliced XBP－1 plasmid elevated XBP－1protein in HKC cells

2．拼接型 XBP－1质粒上调 HKC细胞内FASN、ACC mRNA表达

FASN和ACC是脂肪酸代谢中的关键酶，转染拼接型XBP－1质粒的 HKC细胞FASN和ACC mRNA均明显升高，分别是空质粒转染组的2．07倍和1．82倍；然而，非拼接型XBP－1质粒对 HKC细胞FASN和ACC mRNA的表达未产生明显影响（Fig．2）。

图2 拼接型XBP－1质粒升高了HKC细胞FASN和ACC mRNA的表达Fig．2The spliced XBP－1plasmid increased FASN and ACC mRNA in HKC cells

3．拼接型XBP－1质粒升高了HKC细胞ADRP表达和细胞内脂滴

ADRP是细胞内脂滴的标记蛋白，相比于空质粒转染组和非拼接型XBP－1质粒转染组，拼接型XBP－1质粒显著升高了HKC细胞内ADRP蛋白的表达（Fig．3）。油红O染色被用来检测细胞内脂滴形成情况，结果揭示拼接型XBP－1质粒可明显升高HKC细胞内脂滴（Fig．4）。

图3 免疫细胞化学检测HKC细胞ADRP表达 （×400）A：正常对照组；B：空白质粒组；C：拼接型XBP－1质粒组；D：非拼接型XBP－1质粒组Fig．3ADRP expression in HKC cells of immunocytochemistry（×400）A：normal control group；B：blank plasmid group；C：spliced XBP－1plasmid group；D：unspliced XBP－1plasmid group

图4 油红O染色检测HKC细胞内脂滴 （×400）A：正常对照组；B：空白质粒组；C：拼接型XBP－1质粒组；D：非拼接型XBP－1质粒组箭头示细胞内脂滴Fig．4Lipid droplet formation of HKC cells by Oil Red O staining（×400）A：normal control group；B：blank plasmid group；C：spliced XBP－1plasmid group；D：unspliced XBP－1plasmid group arrows show cellular lipid droplets

讨 论

X－盒子是位于人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）DR alpha启动子区的保守转录元件，X－盒子结合蛋白1是一种结合于X－盒子的转录因子［6］。由非拼接型XBP1（μ）mRNA翻译而来，分子量为33kDa，XBP1（μ）蛋白具有DNA结合区域，但没有活性区域。XBP1（μ）mRNA 经IRE1拼接后，阅读框发生移位，翻译后形成54kDa大小的蛋白，即拼接型 XBP－1（s）蛋白，含有DNA结合区和活性区［7］。

有研究揭示XBP－1有多种功能，如浆细胞分化［8］，病毒复制，内质网应激反应［9］，最近有报道证实XBP－1有新的功能，可通过影响肝脏的脂质代谢降低血清甘油三酯和胆固醇的含量［4］。随后陆续有研究也揭示了XBP－1对脂质代谢的影响。So JS等人发现XBP－1缺乏反馈性激活上游的IRE1α，进而启动调节性IRE－1依赖性降解过程（regulated IRE－1－dependent decay，RIDD），导致细胞内 mRNAs的降解，参与调控细胞的脂质代谢。抑制调节性IRE－1依赖性降解过程或IRE1α可逆转XBP－1基因敲除小鼠的低脂血症。而在高血脂的动物模型，抑制XBP－1可有效改善肝脏脂肪变性、肝脏损伤和高胆固醇血症［10］。Gregor MF等人在哺乳期的小鼠发现，敲除脂肪细胞的XBP－1减少了奶的产量，幼鼠生长缓慢，提示脂肪细胞XBP－1对哺乳期的脂质代谢有重要影响［11］。

肾脏脂质沉积见于多种疾病，如糖尿病肾病，肾小球肾炎，狼疮性肾炎，是引起肾脏硬化和功能不全的重要因素之一［12］。ADRP首先由Ginette等人克隆［13］，是一种脂滴标记蛋白。目前，XBP－1蛋白是否对肾脏固有细胞ADRP表达和脂质代谢有影响还未见研究。本研究针对肾小管上皮细胞，研究了XBP－1蛋白对细胞内脂质代谢的影响，结果揭示非拼接型XBP－1质粒和拼接型XBP－1质粒转染人肾小管上皮细胞后，分别升高了非拼接型XBP－1蛋白和拼接型XBP－1蛋白表达。然而，只有拼接型XBP－1蛋白升高可增强FASN、ACC mRNA表达，继而使ADRP表达升高，细胞内脂滴增多，提示XBP－1蛋白的拼接是引起肾小管上皮细胞脂质合成增多的机制之一。Sha等人的研究也证实XBP－1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞和3T3－L1细胞均呈现明显的脂质生成障碍［14］。综上所述，肾小管上皮细胞拼接型XBP－1蛋白升高可导致细胞内脂质合成相关基因表达增强，细胞内脂滴增多，可能是多种肾脏疾病出现脂质沉积的机制之一。

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