慢性复合应激对大鼠大脑皮质生长休止蛋白7表达影响的研究

李 伟 彭建安 胡红梅 廖家万＊

（1井冈山大学临床医学院，2井冈山大学医学院，吉安343009）

生长休止蛋白7（Gas7）属于生长休止基因家族的一员，是一种与细胞分化和活化相关的重要调节因子［1］。有研究表明Gas7主要表达在大脑皮质、小脑、海马等部位［2，3］，在某些条件下，它可诱导胚胎干细胞［4］、PC12细胞或神经瘤细胞向成熟和终末方向发育和分化［5，6］；Gas7在神经系统过度表达可导致神经突起异常增生，同时Gas7还具有潜在的神经保护作用以抑制神经毒素对神经元的损伤［6］。本课题组在早期研究中发现慢性复合应激可以提高学习记忆，且在慢性复合应激的海马中Gas7表达增强，而在大脑皮质中的表达如何？目前尚未见报道。本研究采用形态学和分子生物学相结合的方法，以多种应激原对大鼠进行长达42d的应激，观察慢性复合应激大鼠海马神经元Gas7的蛋白含量表达变化，进一步探讨慢性复合应激大鼠大脑皮质Gas7表达可能的功能意义。

材料和方法

1．实验动物分组和动物模型的制备

雄性Wister大鼠（10w左右，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供）36只，体重200g左右，将动物随机分为2组：（1）正常对照组（n＝18）；（2）慢性复合应激组（简称应激组，n＝18）。

自制应激原器材为：电动垂直转轮旋转器，其上挂载多个小的金属网鼠笼，每笼只置1只大鼠；圆锥形金属网筒捆绑器；睡眠剥夺水池：长×宽×高为120cm×120cm×120cm，池内水深50cm，池中有多个立柱，间距10－20cm，柱顶面积为16cm2，离水面15cm，单个大鼠置柱顶上；自控时间的夜间光照器。

应激组动物每天处于垂直转轮旋转器上旋转、金属网筒捆绑器中捆绑、水池中睡眠剥夺，或夜间间歇性光照4种应激原无规律交替刺激的环境中达6 w；前3种白天进行，每天进行一项，且间歇性地持续6h，后者晚间进行，光照呈无规律间歇式进行；对照组动物仅按常规喂养，同样摄食饮水。

2．免疫组织化学测定

2．1标本的制备

取实验组和对照组大鼠各9只，经7%水合氯醛腹腔注射麻醉后，行开胸经左心室至升主动脉插管，先用37℃生理盐水100ml快速灌流冲洗血液，再用预冷的含4%多聚甲醛的0．1mol／L PB（pH7．4）300ml作灌流固定。取脑并修取端脑一段在上述固定液中后固定约6－8h（4℃），再用0．1mol／L PB（pH7．4）浸洗两次后，常规上行酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。然后用石蜡切片机行连续冠状切片，片厚5μm，贴于硌矾－明胶载片，烤干备用。

2．2免疫组织化学反应

Gas7免疫组织化学染色：切片常规脱蜡入水，0．3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，3%牛血清白蛋白（BSA）封闭非特异性反应，兔抗Gas7多克隆抗体（1∶10000，华中科技大学同济医学院组胚教研室刘胜洪教授提供）室温下孵育切片过夜；生物素化羊抗兔Ig G（1∶200，北京中山）室温下孵育1h；SP（1∶200，北京中山）室温下孵育1h。用抗体稀释液替代兔抗Gas7多克隆抗体进行阴性对照，反应呈阴性。

2．3运用Image－Pro Plus

Version 5．0彩色图像分析系统，以切片背景作背底校正，对每张切片大脑皮质的免疫反应产物进行光密度测定，并进行统计学分析。

3．Western blot测定

2组大鼠中各取9只快速断头取相同重量的端脑一部分，加入细胞裂解液（50mmol／L Tris－HCl pH 7．4，50mmol／L NaCl，1%Triton－100，1mmol／L EDTA pH8．0，100μg／ml PMSF，胃酶抑制剂8μl，胰酶抑制剂200μl）匀浆，转移至离心管中，超声破碎；12000r／min 4℃离心20min，取上清；加上样缓冲液（2mol／L Tris－HCl pH6．8，20%SDS，0．25%甘油，10%β－巯基乙醇，0．5%溴酚蓝）；取样品加到各个泳道，恒压（110v）电泳，12%SDS－PAGE分离蛋白样品，；将蛋白质转移到NC膜上，275mA恒流转膜，2h，室温下将 NC膜用5%脱脂牛奶／0．01mol／L PBS封闭1h；用兔抗Gas7多克隆抗体（1∶10000）4℃过夜；5%脱脂牛奶／0．01mol／L PBS漂洗3次，每次10min；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G（1∶200）室温孵育2h；漂洗膜，用化学发光试剂（ECL plus Western－blot Detection System，Amersham）在X线胶片曝光后进行观察。将X光胶片置于疑胶成像分析系统（美国Bio－Rad公司）测定目标带单位密度，与内参照组单位密度值相比后再行统计分析。

4．统计学处理

数据均以均值±标准差（¯x±s）表示，用统计学软件SPSS－11．5进行统计学检验，做t检验，P＜0．05为具有统计学意义。

结 果

1．Gas7免疫组织化学结果

Gas7免疫阳性产物为棕黄色细小颗粒，表达在大鼠神经元的胞浆和突起内，神经胶质细胞内无阳性表达。与对照组相比，慢性复合应激组阳性染色加深，图像分析结果显示：与正常对照组比较，慢性复合应激组平均光密度明显上升（P＜0．05）（图1，表1）。

表1 二组大鼠大脑皮质Gas7表达水平的比较（±s，n＝9，OD值）Table 1 Gas7expression levels in rat cerebral cortex of both groups±s，n＝9，ODrayio）

表1 二组大鼠大脑皮质Gas7表达水平的比较（±s，n＝9，OD值）Table 1 Gas7expression levels in rat cerebral cortex of both groups±s，n＝9，ODrayio）

＊ 与对照组比较（compared with control group），P＜0．05

组别（Groups） 动物数（n） 结果（Results）对照组（Control）9 0．230±0．028复合应激组（Stressed） 9 0．311±0．043＊

图1 正常对照组组（A）和复合应激（B）大鼠大脑皮质Gas7免疫反应性的分布。SABC×200Fig．1Distribution of the Gas7immunoreactivities in the cerebral cortex of rats in control group（A）and multiple stressed group（－B）．SABC×200

2．Western blot分析结果

Western blot检测表明，复合应激组大鼠大脑皮质Gas7表达明显增强，与正常对照组相比，差异具有显著性（P＜0．05）（图2，表2）。

表2 二组大鼠大脑Gas7的Western blot定量分析结果（¯x±s，n＝9，OD值）Table 2 Western blot analyses of Gas7level in cerebral cortex of rat（¯x±s，n＝9，ODrayio）

图2 对照组（A）与应激组（B）大鼠海马Gas7蛋白水平（Gas738kDa；β－actin，42kDa）Fig．2The levels of Gas7protein（Gas7，38kDa andβactin 42kDa）in hippocampus of rats of the control group（A）and the multiple stressed group（B）．Western blot

讨 论

生长休止基因家族是一种与细胞分化和活化相关的重要调节子［1］，他们能够编码一些蛋白，其中生长休止特定蛋白7（Gas7）就是其中的一种，它最先是在去血清的NIH3T3细胞和PC12中分离出来的［7］，后来发现它广泛地分布于大脑皮质、海马、小脑，其它一些器官也有表达［8］，目前的研究表明，在神经系统中，Gas7主要表达在神经元的核周质中，在神经胶质细胞中表达较少［4］。在人类成神经元瘤检测中发现Gas7位于染色体17p11．3，或在等臂染色体17q的假定断裂点内［9］。最近的研究认为，在某些条件下，Gas7可诱导胚胎干细胞［4］、PC12细胞或神经瘤细胞向成熟和终末方向发育和分化［5，6］；文献报道，Gas7在神经系统过度表达可导致神经突起增生，同时Gas7还具有潜在的神经保护作用以抑制神经毒素对神经元的损伤［6］。

本研究采用慢性复合应激对大鼠进行长达6w的饲养，观察大鼠大脑皮质中Gas7表达的变化以及细胞的调亡情况，探讨Gas7的功能以及慢性复合应激对它的影响。我们的研究观察到，Gas7免疫阳性产物为棕黄色细小颗粒，表达在大鼠大脑皮质中神经元的胞浆和突起内，神经胶质细胞内无阳性表达。与对照组相比，在慢性复合应激组免疫反应性明显增强，提示Gas7蛋白含量增多；而且在神经元的突起中，慢性复合应激组比对照组更为明显；Western blot结果显示，慢性复合应激组大鼠海马Gas7免疫反应阳性表达增强，提示Gas7蛋白含量增多。

我们在早期研究中发现慢性复合应激可以提高学习记忆，大脑皮质是学习记忆的一个关键脑区，而目前的研究发现在慢性复合应激大鼠大脑皮纸中Gas7的表达明显增强，且Gas7是一种与细胞分化和活化相关的重要调节因子，提示Gas7参与了慢性复合应激对大鼠大脑皮质神经元生长发育的影响；有可能是促进神经元的活性以及抑制神经毒素对神经元的损伤而提高学习记忆。而Gas7究竟以何形式参与慢性复合应激提高学习记忆？其机理还有待于研究。

［1］Shain SA．Exogenous fibroblast growth factors maintain viability，promote proliferation，and suppress GADD45alpha and GAS6transcript content of prostate cancer cells genetically modifield to lack endogenous FGF－2．Mol Cancer Res，2004，2（11）：653－661

［2］Ju YT，Chang AC，She BR，et al．Gas7：agene expressed preferentially in growth arrested fibroblasts and terminally differentiated Purkinje neurons affects neurite formation．Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95：11423－11428

［3］钱长晖，宋国颖，王小丽等．生长休止蛋白7在大鼠小脑皮质中的免疫细胞化学研究．中国组织化学与细胞化学杂志，2007，16（2）：233－235

［4］Moorthy PP，Kumar AA，Devaraj H．Expression of the GAS7gene and Oct4in embryonic stem cells of mice［J］．Stem Cells Dev，2005，14（6）：664－670

［5］Chao CC，Su LJ，Sun NK，et al．Involvement of Gas7 in nerve growth factor－independent and dependent cell processes in PC12cells．J Neurosci Res，2003，15，74（2）：248－254

［6］Lortie K，Huang D，Chakravarthy B，et al．The gas7 protein potentiates NGF－mediated differentiationof PC12 cells［J］．Brain Res，2005，1036（1－2）：27－34

［7］Manning J，Correia．Neuronal plasticity：adaptation and readaptation to the environment of space．Brain Research Reviews，1998，28：61－65

［8］Chi Wai SO，Holger Karsunky，Piu Wong，et al．Leukemic transformation of hematopoietic progenitors by MLL－GAS7in the absence of Hoxa7or Hoxa9．Blood，2004，103：130－134

［9］Chang PY，Kuo JT，Lin－Chao S，et al．Identification of rat Gas7isoforms differentially expressed in brain and regulated following kainate－induced neuronal injury．J Neurosci Res，2005，79（6）：788－797