恶性胸腔积液中肺腺癌细胞的EGFR、ERCC1、TYMS、TUBB3和RRM1的表达及分子生物学意义

刘吉锋 周美卓 王秀茹 李建华

（1沈阳市红十字会医院病理科，2中国医科大学附属第一医院病理科；辽宁110013）

在癌症引起的死亡中，肺癌占首位，其中非小细胞肺癌（NSCLC）大约占84%，而NSCLC中大约15．9%发生胸腔转移形成恶性胸腔积液，以腺癌最多，临床分期属于ⅢB或Ⅳ期［1］。晚期或转移性NSCLC已失去手术治疗的机会，临床上以铂类药物为基础的联合化疗已经成为治疗晚期NSCLC癌症最主要的方法。酪氨酸激酶抑制剂可用于表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突变NSCLC的靶向治疗。

近年切除修复交叉互补基因1（excision repair cross complementation1，ERCC1）、胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TYMS）、核糖核苷酸还原酶（ribonucleotidereductase，RR）、Ⅲ型β微管蛋白（β－tubulin－Ⅲ，TUBB3）是被研究较多的四种耐药基因，它们在DNA的修复、复制和细胞分裂过程中发挥重要作用。已有多项临床研究显示：它们的表达能够引起相应化疗药物的抵抗，相对应抵抗的药物为顺铂、培美曲塞、吉西他滨和紫杉醇等［2－5］。

EGFR是广泛存在于细胞膜上的一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶，其高表达可以促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭和转移［6］，且它的高表达与其发生基因突变密切相关［7］，而其突变型对酪氨酸激酶抑制剂敏感。

本文通过恶性胸腔积液中肺腺癌的免疫细胞化学检测，对肿瘤细胞中 EGFR、ERCC1、TYMS、TUBB3和RRM1的表达情况和表达差异性性进行分析，为晚期肺癌患者临床化疗用药提供参考价值。

材料和方法

1．临床样本

收集2011到2014年沈阳市红十字会医院门诊及病房胸腔积液，未接受过治疗的112例肺腺癌患者恶性胸腔积液作为研究对象，经细胞病理诊断及组织水平核实和免疫化学染色诊断为肺腺癌。112例中男47例，女65例，年龄从38至87岁，平均年龄为57岁。

2．液基细胞薄层检测技术（ThinPrep Cytology Test，TCT）

收集新鲜胸水25ml左右，室温下2000r／min离心5min，弃去上清液，加入清洗液再次离心后，弃去上清液，取底层沉淀细胞与保存液混合后，机器Thinprep5000自动制片，并进行染色和镜下诊断。

3．切片制备与HE染色

采用TCT常规制片，诊断后，每份标本收集新鲜胸水200ml左右，室温下2000r／min离心5min，取细胞沉渣，经95%乙醇固定12h后梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片，HE染色后，镜下观察，筛选切片。

4．免疫细胞化学染色检测

免疫细胞化学方法采用EnVision法。切片常规脱蜡、脱水，抗原修复均采用高温高压法，具体染色步骤按照试剂说明书进行。检测试剂盒购自福州MAIXIN＿BIO公司。

免疫化学染色结果判定：记录各级切片中染色细胞的百分数，分为5级：0分：染色细胞＜5%；1分：染色细胞5%－25%；2分：染色细胞25%－50%；3分：染色细胞50%－75%；4分：染色细胞＞75%。染色强度分为4级，0分：不显色；1分：浅黄色；2分：棕黄色；3分：深棕色。每份切片计分＝染色细胞计数分数×染色强度分数，所得分数＜1分为阴性结果，反之为阳性，2－3分为弱阳性（＋），4－5分为中等强度阳性（＋＋），＞5分为强阳性（＋＋＋）。

5．统计分析

统计数据分析采用SPSS17．0统计软件，阳性率比较采用chi－square test，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

经TCT镜下初步诊断为可疑瘤细胞（如图1A所示）。HE及免疫细胞化学结果显示上皮性肿瘤标志物CK7和TTF－1表达阳性（图1B－D）。EGFR阳性部位为细胞膜和细胞浆（图2A－C），阴性、弱阳性、中等强度阳性和强阳性表达率分别为0．9%（1／112）、15．2%（17／112）、40．2%（45／112）和43．7%（49／112）（表1），ERCC1、TYMS、TUBB3和RRM1分别表达于细胞核、细胞核和细胞浆、细胞浆、细胞浆，表达率分别为40．2%（45／112）、41．1%（46／112）、75%（84／112）和83%（93／112）（图3A－D）（表1），在不同EGFR表达强度下，ERCC1、TYMS和TUBB3表达率不同且具有差异性（表2）。

表1 恶性胸腔积液中肺腺癌细胞的EGFR、ERCC1、TYMS、TUBB3和RRM1的表达率Table 1 The positive expression rate of EGFR、ERCC1、TYMS、TUBB3and RRM1

图1 A－B：恶性胸腔积液中肺腺癌细胞的TCT和HE染色。C－D：CK7、TTF－1在肺腺癌细胞中的表达．（×400）Fig．1A－B：TCT and HE staining of lung adenocarcinoma cells in malignant pleural effusionC－D：The expression of CK7、TTF－1in lung adenocarcinoma cells．（×400）

图2 A－C：恶性胸腔积液中肺腺癌细胞的EGFR弱阳性（＋）、中等强度阳性（＋＋）、强阳性（＋＋＋）．（×400）Fig．2A－C：weakly positive expression（＋）、the positive expression（＋＋）、the strong positive expression of EGFR（＋＋＋）of lung adenocarcinoma cells in malignant pleural effusion．（×400）

讨 论

晚期或转移性NSCLC已失去手术治疗的机会，联合化疗成为其治疗的主要方法。一线治疗的化疗方案包括以铂类为基础的联合化疗和酪氨酸激酶抑制剂的靶向治疗。EGFR基因突变的主要集中在19和21位点，已有研究报道：对EGFR基因突变患者使用吉非替尼或厄洛替尼，可显著延长患者PFS，且具有良好的耐受性。同时，亚裔、女性、不吸烟及腺癌患者为 EGFR－TKI治疗的优势人群［6］。在恶性胸腔积液中的癌细胞以腺癌居多，所以对EGFR的突变检测具有重要意义。Guiyang等用免疫细胞化学方法研究结果显示：恶性胸腔积液中肺腺癌细胞的EGFR突变率与其阳性表达强度密切相关，表达越强其突变率越高［7］。ImIl Na等研究也显示，具有胸腔转移的肺癌患者具有较高的EGFR突变率［8］。在我们对112例恶性胸水中肺腺癌细胞的研究中显示，EGFR强阳性表达率达43．7%，这对临床用药具有直接参考价值。

在晚期患者的临床化疗中，以铂类为基础的联合化疗也是重要的一线化疗方案，但耐药的出现一直影响化疗效果。ERCC1、TYMS、TUBB3和RRM1是近年报道较多的4种耐药基因，它们的表达与患者的不良预后密切相关［9－12］。在正常的细胞中，这些基因参与DNA的合成与细胞的有丝分裂，但在在肿瘤发生发展的过程中，这些些基因的蛋白表达含量增加，一方面可以加快肿瘤细胞DNA的合成，促进肿瘤的增殖，增强肿瘤细胞的侵袭转移能力。另一方面可以使以这些基因为靶点的药物失灵，产生耐药性。在我们所研究的恶性胸腔积液中的肺腺癌细胞中有一定比例的4种耐药基因的表达，且其表达率与EGFR的表达强度相关，随EGFR的表达强度的增高，有3种耐药基因的表达率也增加。已知EGFR参与多条与癌症相关的信号通路，影响着肿瘤细胞的增殖、凋亡、浸润转移及血管生成等［13，14］，是否也可以调节耐药基因的表达，这需要进一步证实。同时也意味着以铂类为基础的联合化疗和酪氨酸激酶抑制这两种化疗方案的使用可以根据不同的基因表达情况而进行选择，研究结果暗示，这两种化疗方案在某种程度上可以进行互补。

近年来人们提出了针对不同患者进行个体化治疗的概念，治疗方案应该根据患者的临床体征和肿瘤的分子生物学特征来制定，在这些具体的亚型中也许会获得一些益处，组成癌症完全新的本质，并得到相一致的抗肿瘤化疗。恶性胸腔积液是晚期肺癌患者常出现的临床体征，并且比较易采集，如果对恶性胸腔积液进行耐药相关基因的免疫细胞化学染色，这可以作为一种便捷的方式来检测耐药基因的表达情况，并以此为依据指导临床用药，进行合理的个体化治疗，对于改善患者预后、减轻患者的经济负担具有重要实际意义。

［1］Morgensztern D，Waqar S，Subramanian J，et al．Prognostic Impact of Malignant Pleural Effusion at Presentation in Patients with Metastatic Non－Small－Cell Lung Cancer．Journal of Thoracic Oncology，2012，7（10）：1485－1489

［2］Olaussen KA，Dunant A，Fouret P，et al．DNA repair by ERCC1in non－small－cell lung cancer and cisplatinbased adjuvant chemotherapy．New England Journal of Medicine，2006，355（10）：983－991

［3］Sigmond J，Backus HH，Wouters D，et al．Induction of resistance to the multitargetedantifolatePemetrexed（ALIMTA）in WiDr human colon cancer cells is associated with thymidylate synthase overexpression．BiochemPharmacol，2003，66：431－438

［4］Vilmar AC，Santoni－Rugiu E，Sorensen JB．Predictive impact of RRM1protein expression on vinorelbine efficacy in NSCLC patients randomly assigned in a chemotherapy phaseⅢtrial．Annals of Oncology，2012：1－6

［5］McCarroll JA，Gan PP，Liu M，et al．βIII－Tubulin is a multifunctional protein involved in drug sensitivity and tumorigenesis in non－small cell lung cancer．Cancer Res，2010，70：4995－5003

［6］Bethune G，Bethune D，Ridqway N，et al．Epidermal growth factor receptor（EGFR）in lung cancer：an overview and update．J Thorac Dis，2010，2：48－51

［7］Jiang G，Fan C，Zhang X，et al．Ascertaining an appropriate diagnostic algorithm using EGFR mutation－specific antibodies to detect EGFR status in non－small－cell lung cancer．Plos one，2012，8（3）：1－9

［8］ImIlNa，JongHeon Park，Du Hwan Choe，et al．Association of Epidermal Growth Factor ReceptorMutations withMetastatic Presentations in Non－Small Cell Lung Cancer．ISRN Oncology，2011：1－6

［9］Gao Z，Han B，Shen J，et al．ERCC1protein as a guide for individualized therapy of late－stage advanced nonsmall cell lung cancer．Exp Ther Med，2011，2：811－815

［10］Shimizu T，Nakanishi Y，Nakagawa Y，et al．Association between Expression of Thymidylate Synthase，DihydrofolateReductase，and GlycinamideRibonucleotide－Formyltransferase and Efficacy of Pemetrexed in Advanced Non－small Cell Lung Cancer．Anticancer Res，2012，32：4589－4596

［11］Gong W，Zhang X，Wu J，et al．RRM1expression and clinical outcome of gemcitabine－containingchemotherapy for advanced non－small－cell lung cancer：A meta－analysis．Lung Cancer，2012，75：374－380

［12］Dumontet C，Isaac S，Souquet PJ，et al．Expression of class III beta－tubulin in non－small cell lung cancer is correlated with resistance to taxane chemotherapy．Bull Cancer，2005，92：25－30

［13］Mitsudomi T，Morita S，Yatabe Y，et al．Gefitinib versus cisplatin plus docetaxel in patients with nonsmall－cell lung cancer harbouringmutationsof the epidermal growth factor receptor（WJTOG3405）：an open label，randomised phase 3trial．Lancet Oncol，2010，11：121－128

［14］Scagliotti GV，Selvaggi G，Novello S，et al．The biology of epidermalgrowth factor receptor in lung cancer．Clin Cancer Res，2004，l0（2）：4227－4232