成骨细胞中基因表达的调控

靳 慧 葛娅娜 张成仁 许 野 朱兰兰 王秀梅

成骨细胞中基因表达的调控

靳 慧 葛娅娜 张成仁 许 野 朱兰兰 王秀梅＊

（哈尔滨医科大学附属第二医院口腔内科，黑龙江150086）

在骨骼发生、重塑和再生过程中，成骨细胞产生细胞基质蛋白和基质矿化的调节因子，它们来自于间叶细胞的前体细胞，随着成骨细胞的发生、增殖和分化，这些细胞因子经历了一个基因表达的过程。成熟的成骨细胞产生特征性的细胞外胶原基质，随后被羟灰石晶体矿化。除了一些基本功能外，矿化骨是钙和磷的主要载体，还有造血的功能。人类的一些疾病如骨质疏松症、关节炎、骨肿瘤等会导致骨量减少、骨密度降低。成骨细胞形成和修复是整形外科以及牙科修复治疗的基础。理解成骨细胞形成的细胞和分子机制对于更好的治疗这些疾病是非常重要的。

成骨细胞；基因表达；调控

骨骼发育是一个由相应间充质细胞向成骨细胞系和软骨细胞系演变的过程，以及这些前体细胞依次向骨祖细胞、成骨细胞、软骨细胞、破骨细胞终末分化。骨祖细胞经历了一个扩增阶段，以诸如组蛋白、纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原、c-fos、c-Jun和 P21等蛋白的产生为特征［1］。随后，当它们开始生产和使成骨细胞基质成熟时退出有丝分裂，过渡到进行表达基因。例如：碱性磷酸酶、涎蛋白和Ⅰ型胶原［2］。最后，它们表达的基因涉及到细胞基质的矿化，例如：骨钙蛋白、骨桥蛋白和胶原酶。这在很大程度上表明了基因表达和细胞分化的程序是由包括Runx2、osterix、SMADs、NFATc1、和 ATF-4在内的一系列转录因子表达和活化所管理的。这些因子并不是孤立存在的，而是相互作用，形成一个完整的、各种各样的、和谐的信号及基因调控通路。除了上述转录因子，最近发现的MicroRNA也是成骨细胞的基因表达的重要调节因子。现将各个转录因子对于基因表达的作用以及最新发现的转录因子分别做一个介绍。

1.Runx2

Runx2被描述为成骨细胞分化的主要调节因子［3］。它在成骨细胞的诱导、复制和成熟整个过程中都会起作用，并且调节许多成骨细胞基因的表达。许多影响成骨细胞分化的信号通路和转录因子都是通过影响Runx2的产生和活化来调节的。单纯性的Runx2过表达会引起颅骨锁骨发育异常综合症。这是一种以锁骨发育障碍、各种类型的牙齿缺陷、颅骨骨化延迟以及许多其他骨骼异常为特征的疾病。而同型Runx2基因突变的小鼠是无法存活的，因为一系列的矿化骨的缺乏导致其成骨细胞分化障碍［4］。Runx2的表达与其靶基因的表达联系不太密切，这表明Runx2的活化也受其他因子调控。除了它的Runx2蛋白还包括许多结构域，这些结构域通过与辅酶激活物或辅阻遏物结合来调节其转录活性或阻遏物［5-6］。这些控制方式使Runx2对成骨细胞分化起到主要调节作用，它整合各种不同的信号通路以一种短暂精确的方式或激活、或阻遏转录因子，并根据生理需要做相应的改变。

最近的一些报道强调控制Runx2功能的因子和机制。组蛋白乙酰转移酶，例如p300、CBP、PCAF和 MORF 都是 Runx2的辅 激 活 物［7，8］。它们将乙酰基结合到组蛋白和非组蛋白的靶基因的赖氨酸残基上，通过一系列机制包括改变蛋白-蛋白之间的相互作用以及改变蛋白的稳定性来改变蛋白质的功能。在组蛋白核小体中，乙酰化作用与另一个更开放的染色质结构以及位点上增长的转录活性相联系。对Runx2和HDACs之间的相互关系的发现首次证明了组蛋白脱乙酰酶抑制剂降低了一些Runx2阻遏结构域的活性。人们使用候选基因检测的方法表明了HDAC6结合Runx2并且阻遏其活性［9］。随后的研 究表明结合的 Runx2被HDAC3、HDAC4、HDAC5和 HDAC7功能性抑制［10-15］。

小分子抑制剂的HDACs的抑制作用或RNA介导的抑制作用加速体外成骨细胞分化，这表明HDACs可能会成为临床上治疗骨代谢疾病的相关靶点［16-18］。人们认为 HDAC蛋白可形成多元素的复合抑制物，这些复合抑制物由一些辅因子组成，例如 NCOR、SMRT 和 SIN3a，也 包 括 多 样 的HDACs.虽然我们已经弄清楚Runx2基因的表达是通过HDACs独特的机制进行抑制的，并对不同的成骨信号做出了反应，但是这些复合物如何参与调节Runx2的活性，我们仍不得而知。Lamour等人表明Runx2招募HDAC3作为BSP的启动子，这个启动子通过脱乙酰化组蛋白抑制其转录［19］。Jeon等发现BMP2由SMAD依赖机制通过刺激Runx2的乙酰化作用来保护Runx2免遭Smurf1催化的蛋白水解作用。P300引起的Runx2乙酰化与HDAC4和HDAC5相对抗，这二者使乙酰基团远离Runx2，从而促进Runx2介导的蛋白水解作用。有趣的是，雌激素受体相关受体γ是一个表达在成骨细胞上的孤独基因核受体，由BMP2所刺激，它与P300竞争性的结合Runx2并且抑制BMP2诱导的成骨细胞形成。Runx2招募HDAC6和HDAC7到染色质上，然而，这些因子利用独特的、还不完全清楚的机制来抑制Runx2靶基因的转录。HDAC6可以减弱乙酰酶抑制剂的抑制作用，而HDAC7抑制Runx2的机制目前还不十分清楚。BMP2可激活蛋白激酶D1，蛋白激酶D1使HDAC7磷酸化，导致其从细胞核内暂时性游出并保护Runx2免遭HDAC7 的 抑 制［20］。 尽 管 HDAC4、HDAC5 和HDAC7的蛋白结构非常相似，HDAC7似乎并不能影响Runx2的蛋白水平。它们能够从细胞核内游出以应对蛋白激酶的共同聚集。然而在成骨细胞样细胞中，它们不同的亚细胞表型分布对BMP2的刺激有不同的反应。因此，尽管我们在理解HDACs在成骨细胞分化过程中所起的作用已取得了很大的进步，但对其调控机制目前还不十分清楚。

甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）是刺激Runx2与乙酰转移酶相互作用的另一种重要的骨骼生理调节因子。PTH是成骨细胞中MMP-13转录的强抑制剂［21-22］。PTH对这些细胞的刺激导致蛋白激酶A依赖P300结合Runx2，从而增强组蛋白乙酰化和基因转录［23］。PTH也通过一些其他机制来调节Runx2的活性。例如：磷酸化作用［24］以及促进与激活蛋白1（activating protein-1，AP-1）转录因子的相互作用［25］。最后，PTH 通过泛素介导的蛋白水解作用来降低Runx2蛋白的稳定性，限制PTH对成骨细胞基因表达的刺激。

2.Osterix

与成骨细胞分化相关的关键基因Osterix（人类Osterix的同源物也叫specificprotein7，Sp7）是表达在成骨细胞上的锌指转录因子。和Runx2类似，它也有助于成骨细胞的形成［26］。研究表明，在Osterix基因敲除小鼠胚胎中，成骨细胞分化的标志物（Ⅰ型胶原、骨钙素等）的表达水平严重降低或缺失。Ⅰ型胶原是成骨细胞分化最早的标志，也是骨基质中含量最多的蛋白，在野生小鼠16天的胚胎时，成骨细胞Ⅰ型胶原RNA表达水平明显高于皮肤中的成纤维细胞以及间充质细胞，而在Osterix基因敲除小鼠胚胎中，Ⅰ型胶原RNA水平在间充质细胞密集的成骨部位，软骨膜及软骨中的表达均明显低于野生型小鼠。Osterix缺陷的小鼠由于缺乏矿化骨在出生时就会死亡。通过膜内成骨的骨形成是完全的非矿化，而软骨内骨则展示了矿化的软骨区，这表明Osterix专门对成骨细胞起作用［27］。尽管Osterix表达调控对骨形成的重要机制还不完全清楚，我们认为Osterix是Runx2的下游调控因子，因为在Osterix缺陷的小鼠中Runx2的表达是正常的，而在Runx2基因敲除的小鼠中则Osterix表达缺失。到目前为止，Osterix的功能和调控的一些细节还不十分清楚。

3.ATF4

PSK2是由苏氨酸激酶突变引起的Coffin-Lowry综合症，是包括各种不同的骨骼异常的紊乱综合症。在此过程中，ATF4对成骨细胞的作用被识别。PSK2激酶和ATF4缺陷会减少骨量生成［28］，而ATF4的强制性积累可诱导成骨细胞基因的表达［29］。在骨钙蛋白启动子作用下，ATF4和Runx2［30］形成一系列复合物来增强骨钙素的转录。最近的研究进一步表明这个复合物由PTH信号所介导。有趣的是，最近的研究表明成骨细胞内的ATF4通过改变骨钙蛋白和瘦蛋白激素通路来降低胰岛素的产生及其应答，从而调控能量的新陈代谢。

4.SMADS

生长因子家族的骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPS）和 转 化 生 长 因 子 β（transforming growth factor-β，TGFβ）长期被认为是骨骼生理的重要调节因子。TGFβBMP信号通路导致受体激活SMADS的磷酸化和细胞核转位，与DNA直接作用，以及与其他转录因子联合从而调节基因的转录。rSMADS间充质细胞通过诱导Runx2的表达进入成骨细胞系［31］，它们也与Runx2蛋白相互作用协同调节转录［32］。Runx2上的SMAD交互结构域被识别，它与细胞核靶基质序列相连续，这种结构有利于Runx2行使其功能。最近的研究表明在BMP／SMAD／Runx2信号通路之间有一个有趣的反馈回路表明BMPs是通过Runx2来诱导SMAD6的表达，而SMAD6是抑制BMP信号通路的SMAD蛋白抑制剂。SMAD6通过Smurf1刺激Runx2泛素化和降解［33］，这个过程可能是阻止过多的BMP／Runx2介导的骨生成的潜在机制。

5.NFATc1／Calcineurin

NFATc1是在破骨细胞形成和T细胞发展过程中起重要作用的转录因子［34］。在没有刺激的细胞中，NFATc1是高度磷酸化的，它位于细胞质上。细胞内的钙信号通路激活钙调磷酸酶，使NFATc1脱磷酸，允许其细胞核转入和NFATc1介导的基因表达。鉴于NFATc1在破骨细胞分化过程中的重要性。我们预测钙调磷酸酶抑制剂可能抑制吸收和增强骨形成。然而事实上，钙调蛋白抑制剂导致骨量减少。Koga等人解决了这个悖论，证明除了抑制破骨细胞，钙调蛋白抑制剂还通过阻止在成骨细胞中NFATc1和Osterix之间的合成途径来组织成骨细胞的成熟和矿化。在随后的研究中，Choo等人表明过表达活化的NFATc1抑制体外M3C3T3成骨细胞分化，并且作为抑制TCF／LEF转录活性的结果，它还降低骨钙素的表达。

6.microRNAs调控的成骨细胞基因的表达

MicroRNAs（miRs）对成骨细胞的调节作用是一个振奋人心的发现。他们是短的非编码RNA，核苷酸序列从18到25不等。它们通过与mRNAs特定靶基因中3＇-UTR结合来调节基因的表达。或者要么通过靶向mRNAs的衰退，要么通过抑制其转录来抑制基因的表达［35］。许多miRs都是通过抑制成骨细胞的基因来抑制成骨细胞分化的。Li等人发现了BMP-2促进成骨细胞分化的最新的机制［36］。通过RNA的表达复制，他们识别了一系列miRs，这些miRs通过多潜能间充质干细胞C2C12刺激BMP2来降低表达。人们预测miRs阻止了一系列前成骨细胞因子的表达。这样，miRs水平应该提高成骨细胞基因的表达。成骨细胞的扩增受miRs的抑制。主要是抑制ErbB2受体络氨酸激酶［37］。我们已经识别了两种抑制成骨细胞中Dlx5表达的miRs，miR-29a和miR-29c被表达用来抑制细胞外基质骨连蛋白的表达［38］，后者对骨骼的生理过程是非常重要的［39］。并不是所有的miRs都是成骨细胞分化过程中的抑制剂。TGFβ信号通路抑制骨生成，而miR通过抑制Acvr1b（TGFβ的一种类型的受体）对成骨细胞的分化起正面调节作用［40］。

总之，近年来我们在识别成骨细胞中调节基因表达的蛋白及其调控机制方面取得了很大的进步。基因表达的调控和蛋白活性是由不同因素协调控制的，这些发现为我们临床上治疗骨代谢疾病提供了新思路，对原有治疗方法的改进也起到了很好的参考作用。

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R349.64

A

10.3870／zgzzhx.2011.05.016

2011-02-10

2011-04-01

黑龙江省政府博士后启动基金（LRB05-279）

靳 慧，女（1984年），汉族，硕士。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）