小檗碱对CT26皮下移植瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞的影响

李 健 郝 钰 张玉丽 谢 伟 李 军 薛晓鸥＊

小檗碱对CT26皮下移植瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞的影响

李 健 郝 钰 张玉丽1谢 伟1李 军1薛晓鸥1＊

(北京中医药大学基础医学院,北京100029;1北京中医药大学附属东直门医院妇科,北京100700)

目的 观察小檗碱的抑瘤作用及其对肿瘤组织内肿瘤相关巨噬细胞数量的影响。方法 BABL/c小鼠40只随机分2组,全部皮下移植结肠癌细胞(CT26细胞系),次日进行药物干预。治疗组小鼠腹腔注射小檗碱,100mmol/L,200μl/d,14d;对照组腹腔注射等量生理盐水。肿瘤细胞接种7d后连续动态测定肿瘤体积,接种15d处死全部动物,取肿瘤组织、免疫组织化学显色检测肿瘤组织中M2型巨噬细胞标志物CD206及CD68的表达。结果 小鼠皮下移植CT26后,小檗碱治疗组小鼠皮下移植瘤生长缓慢。与对照组比较,肿瘤体积及瘤重均显著减少(P<0.05);皮下移植15d肿瘤组织中可见大量CD206及CD68阳性细胞;肿瘤组织中CD206及CD68阳性细胞数量显著减少(P<0.05 or P<0.01)。结论 小檗碱可能通过抑制肿瘤相关巨噬细胞的形成而发挥抗肿瘤作用。

小檗碱; 肿瘤相关巨噬细胞; CT26

肿瘤的发生、发展与慢性炎症关系密切。炎症反应可募集大量中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞进入肿瘤组织,组成复杂的肿瘤微环境。近年来的研究表明[1],肿瘤组织内包含一种特殊类型巨噬细胞,促进肿瘤组织血管生成、参与肿瘤浸润和侵袭、增加肿瘤的恶性程度,称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)。TAMs表型特征复杂多样,其中巨噬细胞甘露糖受体(macrophage mannose receptor,MMR or CD206)及CD68高表达是 TAMs的主要特征[2]。已知肿瘤微环境中存在较多数量的 TAMs。TAMs不仅与癌前病变关系密切,而且参与肿瘤细胞生长、侵袭和转移等过程[3]。临床观察证实[4,5,6],多种恶性肿瘤组织中均含有较大数量的 TAMs,其表达水平与肿瘤预后呈负相关,干预 TAMs的形成能在一定程度上抑制肿瘤细胞的增殖、浸润及转移,是肿瘤治疗的潜在“靶点”。

小檗碱(Berberine)又称黄连素,是从毛茛科植物黄连 (Captis Chinensis)干燥根茎中提取的一种异喹啉类季铵生物碱,具有广谱抗菌作用,临床主要用于治疗胃肠道疾病。近年来,小檗碱抗肿瘤活性逐渐被研究者重视。已有的研究表明[7,8]:小檗碱的抗肿瘤作用主要通过抑制相关致癌微生物、抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡及调节活性氧自由基(ROS)水平等实现。然而小檗碱对肿瘤微环境中炎症细胞调节及对 TAMs影响的研究尚未见报道。为此本实验以结肠癌CT26皮下荷瘤小鼠为模型,观察了小檗碱在体抑瘤效果及对肿瘤组织中CD68+和CD206+巨噬细胞数量、分布的影响,初步证实小檗碱对 TAMs的形成具有显著抑制作用。具体结果报告如下:

材料和方法

1.材料

SPF级BABL/c小鼠 40只(20±2g,雄性)购自中国中医科学院实验动物研究中心,动物许可证号为SCXK(京2005-0004)。实验动物随机分2组:小檗碱治疗组和溶剂对照组;小檗碱购自成都普瑞法科技开发有限公司;小鼠结肠癌细胞株(CT26)购自中国医科院细胞所;anti-mouse CD68 antibody(clone: FA-11)、anti-mouse CD206 (clone:MR5D3)及F4/80(clone:BM8)一抗均购自Biolegend公司;通用型SP法二抗 PV-6000及AEC显色系统购自北京中衫金桥生物公司;细胞培养所需试剂、耗材购自杭州四季青生物工程材料有限公司。

2.方法

2.1 CT26细胞扩增、计数及皮下移植 按照常规方法体外培养CT26细胞,收获对数期CT26细胞,用无菌生理盐水调细胞浓度为1×107个/ml,每只小鼠右腋部皮下接种0.2ml。接种次日动物随机分2组:荷瘤模型对照组和小檗碱治疗组,每组20只。

2.2 小檗碱干预方法依据已有文献[9]及预实验结果,小檗碱用无菌生理盐水溶解(浓度为100mmol/L)。治疗组小鼠于接种次日起腹腔注射小檗碱0.2ml,每日1次,连续给药14d。荷瘤对照组腹腔注射生理盐水(0.2ml/d,14d)。

2.3 肿瘤体积测量[10]接种肿瘤细胞7d后,用游标卡尺分别测量皮下肿瘤长轴(L)、短轴(W)的长度,每天1次。肿瘤体积(mm3)=1/2×L×W2。

2.4 肿瘤组织石蜡包埋IHC染色 接种肿瘤细胞第15d,动物处死,仔细剥离皮下肿瘤,称重后切取0.5cm×0.5cm大小肿瘤组织,4%多聚甲醛固定。随后行常规石蜡包埋,石蜡切片(0.4μm),F4/80(1:100)、CD68(1:100)及 CD206(1:50)免疫组织化学染色(SP法)、AEC显色、光镜观察、摄片。

2.5 图像分析及数据处理显 微镜下按照5点采样法摄片,应用Image-pro Plus5.0图像分析软件对阳性细胞计数,定量数据运用SPSS11.0软件,作单因素方差分析,两组间比较采用Student’s-t检验,结果以均数±标准差(¯x±s D)表示。

结 果

1.小檗碱可显著抑制皮下移植瘤生长

动态测量CT26皮下移植瘤体积的结果显示,小檗碱治疗组皮下肿瘤生长缓慢。统计结果显示,小檗碱治疗14d时小鼠皮下肿瘤体积约795.8 mm3,溶剂对照组小鼠皮下肿瘤体积约 1988.9 mm3,方差分析差异显著 (P<0.05,如图1-A)。处死动物后,对各小鼠皮下肿瘤进行称重,结果显示,小檗碱治疗组皮下肿瘤平均重量1.54g,溶剂对照组皮下肿瘤重量约3.04g,差异显著(P<0.05,如图1-B)。

图1 小檗碱对BABL/c小鼠皮下接种CT26细胞生长的抑制作用Fig.1 Inhibiting effect on subcutaneous CT26 tumor in BABL/c mice by berberine

2.小檗碱显著减少皮下移植瘤组织中CD68+及CD206+巨噬细胞的数量

光镜下,免疫组织化学A EC显色,阳性反应颗粒呈红色。结果显示:皮下移植瘤组织中含有大量F4/80+单核细胞。图像分析结果表明,小檗碱治疗组与荷瘤模型对照组F4/80+单核细胞数量没有显著差异 (P>0.05,如图2-A、2-a)。CD68及 CD206染色结果显示,皮下移植瘤组织中含有一定数量的CD68+和CD206+巨噬细胞。图像分析结果表明,与溶剂对照比较,小檗碱治疗组皮下肿瘤组织中CD68+及CD206+巨噬细胞数量显著减少(P<0.05或 P<0.01,如图 2-B、2-b、2-C、2-c)。

图2 小檗碱对皮下CT26移植瘤组织内 TAMs数量影响的IHC结果Fig.2 Tumor associated macrophages in subcutaneous CT26 tumor tissue by IHC stainingA,B,C:溶剂对照组;a,b,c:小檗碱治疗组;红色示阳性细胞,其中图A和a、C和c,100×,图B、b,200×

讨 论

巨噬细胞 (Macrophage)是人体固有免疫系统的重要细胞组份,起源于CD34+骨髓祖细胞,以前单核细胞的形式释放进入血液并移行至全身各个器官、组织,转化成特殊的原位驻留巨噬细胞,如肝脏内的库普弗氏细胞(Kupffer cell)、中枢神经系统的小胶质细胞、肺尘细胞、皮肤的朗格汉斯细胞等,统称“单核-吞噬细胞系统”。以往的观点认为[11],巨噬细胞是人体固有免疫系统的重要组成成分,能直接杀伤肿瘤细胞或通过呈递肿瘤相关抗原诱导机体免疫应答从而间接清除肿瘤细胞。但是近年来,越来越多的证据表明[12],肿瘤微环境内的巨噬细胞可分化为功能不同的2种类型,即 M1型和 M 2型。M2型巨噬细胞又称为肿瘤相关巨噬细胞(TAMs),不但没有抗肿瘤作用,反而参与了肿瘤的增殖、浸润及转移等过程。TAM普遍被认可的表型是 IL-4high/IL-10high/IL-12low以及表面标记物 CD68、CD163、CD206等高表达[2,11,12]。本实验通过整体动物实验发现,中药单体化合物小檗碱具有一定的抑瘤作用,同时显著抑制肿瘤组织中 TAMs的形成。该实验结果初步提示:小檗碱可能通过干预TAMs的形成而发挥抗肿瘤的作用。

早在1863年,Virchow就在恶性肿瘤中发现了炎性细胞并设想炎性环境与肿瘤发生关系密切。大量研究表明[13],非甾体类抗炎药(NSAID),特别是COX-2选择性抑制剂具有抗肿瘤作用。Balkwill F.及Mantovani A.的研究工作则证实了Virchow的假说,指出巨噬细胞平衡假说存在大量证据支持,抗炎可能成为预防和治疗肿瘤的新途径[14]。为此从抗炎药物中筛选抗肿瘤新药已成为医药工作者关注的热点。小檗碱是中药黄连的主要活性成分,价廉、低毒,抗炎、抑菌作用明显。黄连始载于《神农本草经》,是历史悠久的传统药物之一,具清热解毒之功效,在肿瘤临床治疗中应用广泛[15]。已有的研究主要侧重黄连及小檗碱抑制肿瘤细胞增殖、转移,诱导肿瘤细胞凋亡、分化等方面。基于小檗碱的抗炎作用,研究其对肿瘤微环境 TAMs调节作用尚属空白。本实验的初步结果提示,与小檗碱类似的具有抗炎、抑菌作用的中药提取物有望成为新型抗肿瘤药物。本实验也为清热解毒中药抗肿瘤提供了新的证据。

综上所述,TAMs是肿瘤发展、浸润、转移的重要调节者。中药提取物小檗碱能有效影响 TAMs的形成,从而抑制肿瘤的增殖。该结果初步提示:清热解毒类中药提取物具有潜在抗肿瘤作用,其抑制肿瘤增殖及恶性程度增加的机制与影响 TAM形成有关。

(＊致谢:本论文是在加拿大Mc Master大学分子医学与病理系万永红教授的指导下完成的,在此向万教授及其领导的课题组表示感谢。)

[1]Solinas G,Germano G,Mantovani A,et al.Tumor-associated macrophages(TAM)as major players of the cancer-related inflammation.J Leukoc Biol,2009,86(5):1065-1073

[2]章必成,王俊,陈正堂.肿瘤相关巨噬细胞的研究进展.临床肿瘤学杂志,2007,12(3):228-232

[3]李晓曦,郭宁,曹雪涛.肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤生长与转移的研究现状.中国肿瘤生物治疗杂志,2008,15(1):78-82

[4]Hiroshi Kurahara,Hiroyuki Shinchi,Yuko Mataki,et al.Significanceof M2-Polarized Tumor-Associated Macrophage in Pancreatic Cancer.J Surgical Res,2009,1:1-9

[5]Sica A,Schioppa T,Mantovani A,et al.Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression:potential targets of anticancer therapy.Euro J Cancer,2006,42(6):717-727

[6]Luo Y,Zhou H,Krueger J,et al.Targeting tumor associated macrophages as a novel strategy against breast cancer.Clin Invest,2006,116(8):2132-2141

[7]杨菁,林菁.小檗碱抗肿瘤作用机制的研究进展,中国中药杂志,2007,32(10):881-883

[8]许成山,周克元.小檗碱抗肿瘤作用研究进展,现代肿瘤医学,2009,17(1):147-150

[9]Chowdhury SA,Fujisawa S,Ishihara M,et al.Tumorspecific cytotoxicity and apoptosis inducing activity of berberines.Anticancer Res,2005,25(6B):4053-4059

[10]RI Geran,NH Greenberg,MM Macdonald,et al.Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems(third edition),1972,3(2):p51

[11]郭强,李康,徐林,等.4T1荷瘤小鼠肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的表型及吞噬功能的研究.中国免疫学杂志,2009,25(3):225-228

[12]Mantovani A,Sozzani S,Locati M,et al.Macrophage polarization:tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes.Trends Immunol,2002,23:549–555

[13]任先达,吕艳青,叶开和,等.非甾体类抗炎药抗肿瘤作用的分子机制.中国药理学通报,2005,21(5):527-531

[14]Balkwill F,Mantovani A.Inflammation and cancer:back to Virchow?Lancet,2001,357(9255):539-545

[15]王莉珍.黄连在治疗恶性肿瘤中应用经验,实用中医内科杂志,2003,17(5):373-374

Berberine inhibits tumor-associated macrophages in subcutaneous tumor of mice

Li Jian,Hao Yu,Zhang Yuli1,Xie Wei1,Li Jun1,Xue Xiaoou1＊
(Pre-clinical College,Beijing University of Trasitional Chinese Medicine,Beijing,100029;1Department of Gynecology of Dongzhi men Hospital,Beijing 100700,China)

Objective To observe the antitumor effect of berberine through inhibiting tumor-associated macrophages in subcutaneous tumor.Methods 40 BABL/c mice were divided into 2 groups:vehicle group and berberine treatment group.CT26 tumor cells were transplanted subcutaneously.Immunohistochemistry was used to examine tumor-associated macrophage phenotypes CD206 and CD68 in subcutaneous tumor tissue.Results Berberine inhibited tumor growth tendency remarkably(P<0.05 vs.vehicle control).The quantity of CD68+/CD206+tumor-associated macrophages were reduced significantly by berberine treatment(P<0.05 vs.vehicle control).Conclusion The anti-tumor role of berberine is achieved by inhibiting the formation tumor-associated macrophages.

Berberine; Tumor-associated macrophage; CT26

R285.5

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.001

2010-11-15

2011-04-01

国家科技支撑项目(2006BAI11B07-02);国家自然科学基金资助(30873268)

李健,男(1970年),汉族,副教授,硕士生导师。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)