猫下丘中央核5-HT、P物质和星形胶质细胞年龄相关变化

罗 勋 王 云 王春花 王顺昌

猫下丘中央核5-HT、P物质和星形胶质细胞年龄相关变化

罗 勋＊王 云 王春花 王顺昌

(淮南师范学院生命科学系,安徽232001)

目的 比较研究青年猫与老年猫下丘中央核(CIC)5-羟色氨(5-HT)、P物质(SP)能神经元及星形胶质细胞年龄性变化,探索老年个体听力下降的神经机制。方法 Nissl染色显示下丘神经元,免疫组织化学ABC法显示5-HT、SP和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫反应(immunoreactive,IR)细胞。光镜下观察、拍照,对神经元和5-HT、SP及 GFAP免疫反应细胞分别计数并换算成密度,测量其 IR细胞直径取平均值,以及它们的阳性反应平均灰度值。结果 5-HT-IR、SP-IR和GFAP-IR细胞、阳性纤维及其终末在青年猫及老年猫下丘中央核均有分布。与青年猫相比,老年猫下丘中央核5-HT密度均显著下降(P<0.01),胞体直径明显减小(P<0.01),阳性反应明显减弱(阳性反应强度与灰度值呈负相关),SP-IR神经元和星形胶质细胞密度却显著增大,阳性反应显著增强。结论 在衰老过程中猫下丘神经元尤其是5-HT能神经元有显著丢失现象,提示5-HT能神经元显著减少导致下丘听觉信息传递功能减弱,可能引起老年个体听觉功能衰退的重要原因;SP能神经元和星形胶质细胞密度显著增大,可能起到延缓衰老的作用。

猫; 下丘中央核; 5-HT; P物质; 星形胶质细胞

脑干听觉中枢-下丘是皮层下听觉信息加工处理的重要中继站,分布着极为丰富的神经元及神经胶质细胞,且丰富的神经元能合成和分泌多种递质,如5-羟色氨(5-HT)和 P物质(substance P,SP),对听觉信息的传递和加工有重要作用。在衰老过程中,下丘组织结构的改变可能导致听觉功能衰退。已有大量研究表明,下丘 GABA能神经元显著丢失及其功能异常可导致老年性个体严重听觉障碍[1-4]。但对下丘5-HT、SP和星形胶质细胞尚少见明确报道。本实验通过定量比较,研究了青年猫与老年猫下丘中央核5-HT、P物质和星形胶质细胞年龄相关形态学变化,以期为听觉功能衰退的神经机制积累形态学资料。

材料和方法

1.材料及组织准备

选用经听觉检查(耳蜗反射)无听觉缺陷的青年猫(1-3龄,体重 2-2.5kg)和老年猫(11-13龄,体重3.0-3.5kg)各4只,盐酸氯胺酮(40mg/kg体重)深度麻醉,开胸后经左心室插管至升主动脉,灌注0.9%的生理盐水,至肝脏发白后灌注含4%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(200ml/kg体重)进行预固定,开颅取出下丘,移入4%多聚甲醛中固定20-24h,PBS(0.1mol/L,p H7.4)冲洗,常规脱水、透明、石蜡包埋,作厚6 m的连续冠状切片,裱片于APES处理的载玻片上,每隔10张切片取1张切片用于Nissl染色、相邻切片用于免疫组织化学染色及阴性对照实验。

2.神经元Nissl染色

Nissl染色采用0.5%焦油紫染色。

3.免疫组织化学染色

石蜡切片脱蜡至水,3%H2O2室温孵育5min,以消除内源性过氧化物酶活性;蒸馏水冲洗,PBS浸泡5min;滴加正常山羊血清,室温孵育10min,封闭非特异性反应部位;倾去血清,勿洗,滴加一抗(兔抗人5-HT多克隆抗体:稀释比1:200),37℃孵育1h;PBS冲洗5min×3;滴加生物素标记二抗(羊抗兔Ig G抗血清),37℃孵育10min;PBS冲洗5min×3;滴加辣根酶标记链酶卵白素过氧化物酶工作液—三抗(ABC),37℃孵育10min,PBS冲洗5min×3;DAB显色,自来水冲洗,脱水,透明,封片。阴性对照实验采用正常山羊血清代替一抗,其余步骤同上。P物质(稀释比 1:200)和 GFAP(稀释比 1:200)多克隆抗体染色方法同5-HT多克隆抗体。

实验所用5-HT、P物质和 GFAP兔抗人血清及配套的免疫组织化学SP试剂盒、DAB购于美国Labvision公司。

4.数据统计与分析

染色后的切片在Olympus BX-51型荧光显微镜下观察、计数、测量、拍照,Nissl染色计神经元密度,免疫组织化学染色计5-HT、P物质能神经元和星形胶质细胞密度及其直径。随机选取20张切片,每张切片在光镜(×200)下取 5个视野,利用 Image-Pro Express 5.1图像分析软件测量视野内5-HT阳性细胞、P物质阳性细胞和 GFAP阳性细胞密度;测量视野内5-HT阳性细胞、P物质阳性细胞和 GFAP阳性细胞直径,取平均值(μm);测量视野内5-HT、P物质和 GFAP阳性反应灰度,取平均值。所有数据采用平均值±标准差(¯x±SD)表示,用t-test进行各指标的显著性检验。

结 果

1.神经元(Nissl染色)

下丘中央核神经元形态、大小不尽相同,有圆形、锥体形、卵圆形、三角形或多极形。胞体及树突为蓝色,其中以圆形较小的颗粒细胞为主(图1,2)。统计结果表明,老年猫下丘中央核神经元平均密度较青年猫的下降12.88%(见附表)[5]。

2.5 -HT、P物质和GFAP(免疫组织化学染色)

下丘中央核5-HT、P物质阳性反应神经元分布均匀,胞体呈棕黄色,多为中等大小的圆形或椭圆形细胞,小部分为形态较大的圆形、椭圆形及多极形细胞(图3,4,5,6)。统计结果显示青年猫5-HT、P物质能神经元占神经元总数的比例为20.43%、35.32%,老年个体的比例为17.08%、46.86%。老年猫下丘中央核5-HT阳性神经元密度较青年猫的下降了27.18%,P物质阳性神经元密度较青年猫的增加了13.47%(见表1)。老年猫5-HT胞体直径较青年猫的减小了2.07μm;青年猫与老年猫的SP胞体直径无显著性差异(见表1)。老年猫星形胶质细胞密度和直径分别增加了41.48%、1.00μm(见表1)。此外,老年猫5-HT能神经元与神经元数的比例较青年猫下降了3.35%,P物质能神经元与神经元数的比例较青年猫的增加了11.54%,以及老年猫5-HT阳性反应神经元灰度值显著增大及P物质能神经元和星形胶质细胞灰度值明显减小(见表2)。t检验表明,老年猫下丘中央核5-HT能神经元数目显著减少及 P物质能神经元数目则明显增加(P<0.01)(见表1);5-HT阳性神经元胞体平均直径明显减小(P<0.01)(见表1);5-HT灰度值显著增大(P<0.01),P物质和星形胶质细胞阳性反应灰度值明显减小 (P<0.01)(见表2)。

表1 青年猫和老年猫下丘中央核神经元和5-HT、P物质能神经元及星形胶质细胞比较(¯x±s)Table 1 A comparison on density and diameter of neurons and 5-HT,SPergic cells,and astrocytes in th ecenter of inferior colliculus of young and old cat(¯x ±s)

表2 青年猫和老年猫下丘中央核神经元和5-HT、P物质、GFAP免疫阳性反应细胞平均灰度值比较(¯x±s)Table 2 A comparison on average gray value of 5-HT,SP,and GFAPimmunoreactive cells in the center of inferior colliculus of young and old cats(¯x ±s)

讨 论

下丘是皮层下听觉信息加工的重要中枢,在听觉神经冲动传导的调节、声源的定位以及音频和音色的辨别等听觉信息处理过程中起重要作用[6]。下丘核分为中央核、外核和背核三个亚部,中央核为听觉核心投射的重要中继核团,主要功能是处理听觉信息[7]。

1.5 -羟色胺 (5-hydroxytryptamine,5-HT),又称血清素(serotonin),是人体重要的活性物质,以色氨酸(tryptophan,Trp)为原料,首先在色氨酸羟化酶(tryptophanhydroxylase,TPH)作用下合成5-羟色胺酸,再在 5-羟色胺酸脱竣酶(5-hydrotryptophen decarboxylase,5-HTPDC)作用下将5-羟色氨酸合成5-HT。5-羟色胺是一种在生物体内以神经递质的形式存在的一元胺,可以从行为和内分泌两方面减小生物对外环境或生物自身生理变化的反应,调控生物体的情绪变化、体温等。5-羟色胺缺乏会引起一系列的生理机能紊乱,在无脊椎动物和脊椎动物的研究中都表明,5-羟色胺合成于一系列神经元中,这些神经元有多样化的突触功能和突触连接,在感觉信号的刺激下,5-羟色胺信号放大,达到抑制突触易化和行为感受性的目的。已有研究显示,秀丽线虫5-羟色胺能神经系统缺陷能够引起感觉信号整合能力的下降;外源施加5-羟色胺可部分恢复5-羟色胺能神经系统缺陷引起的感觉信号整合能力的下降,对于转运再摄取与受体功能缺陷引起的下降却无法恢复[8]。目前研究表明,5-HT耗竭大鼠应激时更容易产生抑郁和焦虑症状,并易导致学习、记忆等认知功能受损,对应激适应能力下降[9]。5-HT作为一种抑制性的神经递质[10-13],在下丘中广泛存在,对传入的听觉信息发挥着重要调节作用。本研究发现,5-HT在下丘中央核亦呈显著的年龄性变化,即老年个体显著减少。免疫组化研究发现,5-HT阳性纤维和终末与 GABA胞能神经元的胞体密切接触[14]。结合生理学研究发现,下丘中央核GABA能抑制性相对减弱可导致其听空间反应阈扩大、方向敏感性下降,提示5-HT与 GABA对传递的信息起到共同的抑制作用,推测老年个体下丘中央核5-HT下降亦可能是听觉功能减退的一个重要原因。

2.SP是一种神经肽,是一种兴奋性神经递质,广泛分布于中枢和外周神经系统,在一些DRG(dorsal root ganglia)神经元的核周质及神经元到脊髓背根的神经传导通路上有很高的含量[15]。近年来研究表明,SP是一种肽能递质,是感觉神经的传导物质,也是感觉神经元生长、发育、成熟的标志,含SP的感觉性神经末梢具有双向传导功能,在向中枢传递受刺激信息时起递质作用,在局部释放 SP及其它肽类物质时起调质作用。SP既是初级感觉神经元的神经递质,又是中枢感觉神经细胞的神经递质或调质,参与听觉信息的传递。已有研究发现,SP能影响不同类型靶细胞的增殖,在皮肤损伤时期,SP参与局部炎症反应及免疫反应,可促进创面的修复[16]。本实验观察显示,老年猫下丘中央核SP含量明显增加,表明在衰老过程中,SP对神经元的损伤有修复作用,同时SP作为兴奋性递质,其含量显著提高,结合已有研究显示 GABA抑制性性递质的显著下降[5],提示兴奋性和抑制性神经递质之间的平衡被打破,听觉信息的正常调制及传输受到影响。

3.胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)作为星形胶质细胞(astrocyte,AS)特异性标志蛋白,可作为星形胶质细胞分化和功能活性的指标。星形胶质细胞在神经系统中起支持、营养、代谢、合成、分泌、维持离子平衡等多种重要作用。已有研究发现,猫在衰老过程中AI区星形胶质细胞的活动增强[17]。本研究结果与其一致,显示老年猫下丘中央核星形胶质细胞密度和直径均显著增大。胶质细胞活动增强可能对衰老中下丘具有保护作用:填充神经元凋亡所产生的基质空缺,维持老年下丘的形态;通过形成的血管周足吸收血液中的营养物质,为下丘提供大量营养,并稳定衰老中神经元周围的微环境,维持其正常的生理功能,延缓下丘进一步衰老。

总之,在衰老过程中,猫下丘中央核5-HT、SP、星形胶质细胞,呈现显著的年龄相关性变化,可能是导致老年个体听力下降的重要原因。但本文仅仅比较分析了三者的变化及可能的生理作用,可导致其发生变化的原因,以及它们之间的作用机制等相关因素都有待进一步探讨。

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图 版 说 明

图1 Nissl染色示青年猫下丘中央核神经元。×200

图2 Nissl染色示老年猫下丘中央核神经元。×200

图3 5-HT免疫组织化学反应示青年猫下丘中央核5-HT阳性反应神经元,5-HT阳性反应神经元(→)。×200

图4 5-HT免疫组织化学反应示老年猫下丘中央核5-HT阳性反应神经元,5-HT阳性反应神经元(→)。×200

图5 SP免疫组织化学反应示青年猫下丘中央核SP阳性反应神经元,SP阳性反应神经元(→)。×200

图6 SP免疫组织化学反应示青年猫下丘中央核 GABAergic能神经元,SP阳性反应神经元(→)。×200

图7 GFAP免疫组织化学反应示青年猫下丘中央核星形角质细胞,星形胶质细胞→)。×200

图8 GFAP免疫组织化学反应示老年猫下丘中央核星形角质细胞,星形角质细胞(→)。×200

EXPLANATIONOF FIGURES

Fig.1 Nissl staining to show neurons in the CIC of young cat.×200

Fig.2 Nissl staining to shows neurons in the CICof old cat.×200

Fig.3 5-HT immunoreaction to show 5-HT ergic cells in the CICof young cat,5-HT ergic cells(→). ×200

Fig.4 5-HT immunoreaction to show 5-HT ergic cells in the CICof old cat,5-HT ergic cells(→). ×200

Fig.5 SPimmunoreaction to show SPergic cells in the CICof young cat,SPergic cells(→). ×200

Fig.6 SPimmunoreaction to show SPergic cells in the CICof young cat,SPergic cells(→). ×200

Fig.7 GFAPimmunoreaction to show astrocytes in the CIC of young cat,astrocytes(→). ×200

Fig.8 GFAPimmunoreaction to show astrocytes in the CIC of old cat,astrocytes(→). ×200

Age-related changes of 5-HT,substance P,and astrocytes in infer ior colliculus center of cats

Luo Xun＊,Wang Yun,Wang Chunhua,Wang Shunchang
(Department of Lif e Science,Huainan Normal University,Anhui 232001,China)

Objective Age-related changes of 5-HT,SP,and astrocytes in the inferior colliculus of young adult and old cats were investigated comparatively,and the neural mechanism of the auditory degeneration during senescence underlying these changes was discussed.Methods Nissl staining was used to display all the inferior colliculus neurons,and immunohistochemical method was used to exhibit 5-HT immunoreactive(5-HT-IR)cells,substance Pimmunoreactive(SP-IR)cells,and astrocytes.Under the microscope,the number of the 5-HT-IR cells,SP-IR cells and astrocytes was counted,and their diameter and density were measured.Results The 5-HT-IR cells,SP-IR cells,astrocytes,fibers and their teminals were distributed widely in central neucli of inferior colliculus in young and old cats.The diameter and density of 5-HT-IR ergic neurons declined,while grey value significantly increased in the old cats when compared with those of the young adults.But SP-IR cells and astrocytes were on the contrary.Conclusion An evident loss of the 5-HT-IR neurons in old inferior colliculus may result in an imbalance of excitement and inhibition,which might be an important reason for the auditory degeneration in senescence.The f unctional increase of SPand astrocytes may delay aging.

Cat; Central of inferior colliculus(CIC); 5-hydroxytryptamine(5-HT);Substance P(SP); Astrocyte

R322.811

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.002

2011-01-14

2011-04-02

国家自然科学基金资助(20907016;21077040);安徽省自然科学基金资助(090413257);安徽省高等学校自然科学基金资助(ZD200909;KJ 2009B156)

罗勋,男(1972年),汉族,硕士,讲师。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)