SIA H2与P-ERK在乳腺癌中的表达及其临床意义

孟 媛 董经宇 甄 娟 孙 洁 宋 敏 李柏林

SIA H2与P-ERK在乳腺癌中的表达及其临床意义

孟 媛 董经宇3甄 娟 孙 洁 宋 敏1李柏林2＊

(中国医科大学基础医学院病理学教研室;1中国医科大学基础医学院病理学教研室及中国医科大学附属第一医院病理科;2中国医科大学基础医学院化学教研室;3中国医科大学92期七年制辽宁沈阳110001)

目的 观察人乳腺细胞系及乳腺组织中SIAH2和P-ERK表达的变化,探讨乳腺癌中SIAH2与P-ERK的关联。方法 应用免疫组织化学检测140例乳腺石蜡包埋组织中SIAH2和P-ERK的表达,Western blot检测人乳腺细胞系和23例乳腺浸润性导管癌及癌旁正常乳腺组织中SIA H2和P-ERK的蛋白表达情况,人乳腺癌细胞系表达SIA H2-siRNA后,P-ERK蛋白表达情况。结果 乳腺癌中SIAH2和P-ERK阳性率与组织学分级相关(P<0.05),SIAH2和P-ERK呈正相关性。人乳腺癌细胞系以及乳腺癌组织中SIAH2和P-ERK蛋白表达量明显高于人乳腺正常上皮细胞系与癌旁正常乳腺组织中SIA H2和P-ERK蛋白表达量 (P<0.05);表达SIAH2-siRNA的乳腺癌细胞系与对照组相比,P-ERK蛋白表达明显减少(P<0.05)。结论 SIA H2、P-ERK过表达与乳腺癌的组织学分级有关。在乳腺癌细胞系中抑制SIA H2表达后,P-ERK表达也减少,因此抑制SIA H2可以抑制 ERK通路。

SIAH2; P-ERK; 乳腺癌; 临床病理特征; 干扰

乳腺癌是危害女性身体健康的恶性肿瘤之一,乳腺癌发生发展与癌细胞异常增殖相关,所以促进乳腺癌发生和生长的相关因子一直是分子生物学的研究重点。SIA H2(seven in absentia homologues)是果蝇SINA(seven in absentia)同系物,是一种 E3泛素连接酶,目前的研究已经证实SIA H2在多种癌中表达都有异常。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase MAPK)途径中的细胞外信号激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)是MAPK家族的重要成员,P-ERK是ERK的活性形式,ERK信号途径因为能够以正性调节的方式调控肿瘤生长而备受关注。已有研究表明SIA H2与P-ERK可能有关联,那么在乳腺癌的发生发展中SIA H2是否与P-ERK具有关联,是否SIA H2可以通过调节活化的 ERK途径发挥作用,这对指导乳腺癌的临床诊断和治疗具有重要临床意义。本研究应用免疫组织化学和Western blot检测P-ERK与SIA H2在乳腺组织中和乳腺细胞系的表达情况,两者的表达是否具有相关性,并进一步研究SIA H2和P-ERK表达与临床病理的联系,评价SIA H2是否可能通过 ERK通路调节乳腺癌细胞生长,为 SIA H2小分子抑制剂应用于乳腺癌治疗提供相应的理论依据,为乳腺癌治疗开辟新途径。

材料和方法

1.临床资料

选择中国医科大学附属第一临床医院病理科140例乳腺患者手术切除肿物的存档蜡块(2007年12月至2009年6月)。患者均为女性,年龄24～71岁。所有患者术前均未做放化疗以及免疫治疗,有完整的病历资料。依据WHO 2003年的乳腺肿瘤组织学分类标准分类,乳腺浸润性导管癌伴淋巴结转移38例,乳腺浸润性导管癌淋巴结无转移38例,乳腺导管原位癌44例,乳腺正常上皮20例。Western blot检测所用的23例乳腺浸润性导管癌(包括76例乳腺浸润性导管癌)及癌旁正常新鲜乳腺组织,切除后立即置于-70℃冰冻保存。

2.材料

人乳腺正常上皮细胞系MCF-10A,和人乳腺癌细胞系MCF-7,MDA-MB-435S为本实验室储备,SIA H2的特异性siRNA(sc-37497)和SIA H2的非特异性 siRNA(control siRNA序列)(sc-5507)购自Santa Cruz公司。

3.主要试剂

鼠抗人SIA H2和P-ERK单克隆抗体,兔抗人ERK多克隆抗体,购自Santa Cruz公司。S-P超敏免疫组化试剂盒(KIT29710)和DAB酶底物显色试剂盒(DAB20030)均购自福州迈新生物技术开发公司。Western blot用,兔抗人多克隆抗β-actin抗体,羊抗兔和兔抗鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。DM EM购自美国 GIBCO。脂质体Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司。

4.方法

4.1 细胞培养及SIA H2-siRNA干扰

MCF-10A,MCF-7,MDA-MB-435S细胞均采用DMEM(含有100 UPml青霉素,100 UPml硫酸链霉素和10%胎牛血清)培养液,0.1%胰酶消化传代,在37℃、5%CO2培养箱中培养。实验时,细胞处于对数生长期且细胞活力良好。在预实验中已经确定SIA H2的 siRNA(sc-37497)可以有效干扰SIA H2。根据脂质体 Lipofectamine2000的说明书,将 SIA H2-siRNA瞬时转染至 MDA-MB-435S细胞中。

4.2 免疫组织化学S-P法

按S-P法试剂盒说明书步骤进行 P-ERK(1:150)、SIA H2(1:200)抗体免疫组织化学染色。PBS代替一抗作为阴性对照,利用已知阳性片作为阳性对照。阳性判定:以黄色或棕黄色颗粒染色为阳性反应,P-ERK阳性表达于细胞浆和细胞核,SIA H2阳性表达于细胞核。参照温媛媛等[1]报道的方法作为免疫组织化学阳性判断标准,即每张切片在光镜下随机选取5个高倍视野(400倍),每个视野计数100个瘤细胞。根据阳性细胞百分率,无阳性细胞为0分,阳性细胞1%-50%为1分,阳性细胞51%-75%为2分,阳性细胞≥75%为3分;按染色强度:1分呈浅黄色,2分呈黄色,3分呈棕黄色。阳性细胞数评分与染色强度评分相乘后得出综合评分,综合评分≥4为阳性表达,<4为阴性。

4.3 Western blot

组织标本处理是,4℃条件下取-70℃冰冻保存1～2g乳腺癌及癌旁正常组织标本加入约5倍湿重的蛋白裂解缓冲液再充分剪碎,经超声匀浆粉碎后,4℃静置一小时;细胞标本处理是,取对数生长期的细胞,加入细胞裂解液后,4℃下静置1h。组织和细胞标本都在低温高速离心(4℃,12000 r/min,30 min),提取上清即为总蛋白。经 12%的 SDSPA GE电泳、转印,脱脂奶粉封闭,抗β-actin(1:500)和抗 P-ERK(1∶400)抗 SIA H2(1∶400)抗ERK(1∶400)4℃下孵育,过夜;二抗室温下孵育2 h,ECL显色,经自动电泳凝胶成像分析仪采集图像。实验重复三次。

5.统计学分析

采用 SPSS17.0统计学软件,进行 Pearsonχ2检验,Spearman’s correlation检验,Fisher’S精确概率法。P<0.05有统计学意义。

结 果

1.SIA H2和P-ERK在乳腺组织中的表达

1.1 SIA H2阳性表达于细胞核,SIA H2在乳腺正常导管上皮(15.0%)、乳腺导管原位癌(56.8%)、乳腺浸润性导管癌(69.7%)中阳性率呈递增趋势(表1),统计学分析结果为SIA H2在乳腺正常导管上皮与乳腺原位癌表达阳性率具有差异(P=0.002),SIA H2在乳腺正常导管上皮与乳腺浸润性导管癌表达阳性率也具有明显差异(P<0.001)。P-ERK阳性表达于细胞浆和细胞核,P-ERK在乳腺正常导管上皮(25.0%)、乳腺导管原位癌(52.3%)、乳腺浸润性导管癌(75.0%)中阳性率呈递增趋势(表1);P-ERK蛋白在乳腺正常导管上皮,与原位癌和浸润性导管癌表达都具有差异(P=0.041,P<0.001)(表 1,图 1)。

图1 SIA H2和P-ERK在乳腺癌中的表达 免疫组化S-P法×400 NBT,正常乳腺上皮;DCIS,乳腺导管内癌;IDC,乳腺浸润性导管癌。Fig.1 The expression of SIAH2 and P-ERK in breast tissue.S-P method×400 NBT,normal breast tissues;DCIS ductal carcinoma in situ;IDCinvasive ductal carcinoma

表1 SIA H2和P-ERK在140例乳腺组织中的表达Table 1 The Expression of SIA H2 and P-ERK in 140 Cases of Breast Tissues

1.2 SIA H2和P-ERK在乳腺癌组织中蛋白表达明显高于配对的癌旁正常乳腺组织,且SIA H2和P-ERK在乳腺癌和癌旁正常乳腺组织的表达差异具有统计学意义(P<0.05)(图2)。

2.SIA H2和P-ERK在乳腺癌中的关系

76例乳腺癌中SIA H2和 P-ERK表达进行相关分析,经spearman相关性检验,结果显示SIA H2和P-ERK表达呈正相关(rs=0.480,P<0.001)(表2)。

图2 SIAH2和P-ERK在乳腺癌和癌旁正常乳腺组织中蛋白的表达N,癌旁正常乳腺组织;C,乳腺癌组织;2A乳腺浸润性导管癌和癌旁正常组织中SIA H2和P-ERK表达情况;2B SIA H2和P-ERK与β-actin相比后蛋白相对表达量。Fig.2 The expression of SIAH2 and P-ERK in in breast cancer tissues and the adjacent normal breast tissues.N,adjacent normal breast tissues;C,breast cancer tissues;2A The expression of SIA H2 and P-ERK in breast cancer tissues and adjacent normal breast tissues;2B The relative protein expression of P-ERK and SIA H2 compared withβ-actin.bar,SD.

表2 SIA H2和P-ERK在76例乳腺癌组织中的关系Table 2 Relationships Between the Expression of SIA H1 and P-ERK in76 Cases of Breast Cancer Tissues

3.SIA H2和P-ERK在乳腺癌中的表达与临床病理特征之间的关系

76例乳腺浸润性癌中SIA H2和 P-ERK阳性率与组织学分级相关且组织学分级越低,SIA H2和P-ERK(SIA H2,P=0.019;P-ERK,P=0.005)阳性表达率越高(表3)。SIA H2在ER或PgR高表达时阳性率高(P值都小于0.001)(表3)。

表3 SIA H2和P-ERK在76例乳腺癌中的表达与临床病理特征的关系Table 3 Relationship between SIA H2 and P-ERK protein expression and clinicopathological facors in invasive ductal carcinoma

4.SIA H2和P-ERK在乳腺细胞系中的表达

SIA H2和 P-ERK在MCF-10A中蛋白表达量明显低于在MCF-7和MDA-MB-435S蛋白表达量,且具有统计学意义(P<0.05)。SIA H2在细胞系MDA-MB-435S中蛋白表达高于在MCF-7细胞系蛋白表达且具有统计学意义(P<0.05)(图3)。

图3 SIAH2和P-ERK在乳腺细胞系中蛋白表达3A MCF-10A,MCF-7,MDA-MB-435S中SIAH2和 P-ERK表达情况。3B SIAH2和 P-ERK与β-actin相比后蛋白相对表达量。Fig.3 The expression of SIAH2 and P-ERK in breast cell lines3A The expression of SIAH2 and P-ERK in MCF-10A MCF-7,MDA-MB-435S;3B The relative protein expression of PERK and SIAH2 compared withβ-actin.bar,SD.

5.蛋白转染SIA H2-siRNA的MDA-MB-435S细胞系中P-ERK表达

在人乳腺癌细胞系 MDA-MB-435S表达 SIA H2-siRNA后,P-ERK蛋白表达明显减少,且具有统计学意义(P<0.05)(图4)。

图4 在MDA-MB-435S细胞系中表达SIAH2-siRNA后,P-ERK表达减少4A MDA-MB-435S表达control-RNA和SIA H2-siRNA后P-ERK表达情况;4B SIA H2和P-ERK与β-actin相比后蛋白相对表达量Fig.4 The expression of P-ERK in human breast cancer cell lines MDA-MB-435Swas downregulated by SIA H2-siRNA.4A The P-ERK levels were decreased in MDA-MB-435S cell transfected with SIA H2-siRNA compared with the cells transfected with control-siRNA or untreated;4B The difference of P-ERK expression in MDA-MB-435Scells transfected with SIAH2-siRNA(P<0.05),control-siRNA and untreated were statistically significant.bar,SD.

讨 论

人类SIA H(seven in absentia homolog)基因包括 SIA H1和 SIA H2[2-3]二者是高度保守,且 SIA H与果蝇属 SINA是同系物,SIA H2与 SINA具有68%的一致性[4]。SIA H2编码325个氨基酸,SIA H1编码282个氨基酸,SIA H2比SIA H1具有更长的N-末端,SIA H2与 SIA H1具有85%的一致性[3]。SIA H2的N-端是一个包含2个环域结构的催化区域,C-端是高度保守的底物结合区(SBD)[2,5]。具有环域结构的SIA H2是 E3泛素连接酶中的一员,它可以促进与其相互连接的蛋白OBF-1[6],N-Co R[7],TRAF2[8],BA G-1[9],DCC[3]PHD3[10]及本身发生以泛素化和蛋白水解[3,11]。近期实验研究主要在Ras通路、缺氧反应方面研究SIA H2在肿瘤中的作用,一方面已证明SIA H2是RAS通路最下游的因子,抑制SIA H2后,肿瘤生长受到抑制[12-13];另一方面在肿瘤低氧时,SIA H2可以促进PHD泛素化降解进而使 HIF-1α增多,所以抑制SIA H2就可以抑制 HIF-1α减少,使肿瘤生长受到抑制[5,10]。以上的研究结果都暗示,SIA H2具有促进肿瘤生长的作用,但SIA H2通过什么方式促进肿瘤的生长仍是不明的。我们的研究结果,SIA H2在正常乳腺组织、乳腺导管原位癌、乳腺浸润性导管癌中阳性率呈递增趋势,另外SIA H2在乳腺导管原位癌、乳腺浸润性导管癌中阳性表达率明显高于正常乳腺组织且具有统计学意义(P<0.05)。SIA H2蛋白在乳腺癌组织中表达强于配对的癌旁正常乳腺组织,二者有明显的差异,具有统计学意义(P<0.05)。在乳腺癌中SIA H2表达与患者组织学分级相关。这也同Schmidt研究相似,SIA H2在有增殖能力的细胞中表达明显[12]。通过我们的研究,可以推断SIA H2与乳腺癌发展有关。

ERK是MAPK(Mitogen Activated protein kinase,丝裂原活化蛋白激酶)家族成员之一,包括两个重要成员ERK1/ERK2。ERK在MAPK途径中不仅作为转录因子,而且是膜蛋白[14]。P-ERK是ERK活化的形式。在对于 ERK的研究中发现,PERK异常或过度表达在细胞恶性转化及演进中起重要作用[15]。Schmidt研究表明SIA H2是RAS介导的肿瘤发生所需要的,在胰腺癌细胞系中抑制SIA H2功能后 ERK/MAPK信号也减弱[12-13]。在另一项研究中,SIA H2可以引起Sprouty2的降解[16],而Sprouty2可以调控 P-ERK。以上研究都表明SIA H2可能与P-ERK具有相关性。我们的统计学结果分析出SIA H2与P-ERK表达具有正相关性。在MDA-MB-435S细胞系转染SIA H2-siRNA后,P-ERK表达也明显减少。通过以上结果,我们可以推断出SIA H2可能通过 ERK通路发挥促进乳腺肿瘤生长作用。

我们的统计学分析结果表明在 ER和 PgR高表达的乳腺癌中SIA H2阳性率高。Maurice[17]的研究结果表明在雌激素受体(ER)阳性乳腺癌细胞系中,SIA H2的mRNA水平是明显上调的,我们的统计学分析结果与其是一致的。但我们在分析SIA H2在乳腺癌细胞系表达时发现,SIA H2在ER低表达的MDA-MB-435S细胞系中蛋白表达强于ER高表达的MCF-7细胞系中SIA H2蛋白表达,可能是因为在侵袭能力强的细胞系中SIA H2蛋白表达更强。

综上所述,SIA H2和 P-ERK在乳腺癌中都异常表达,并且二者具有正相关性。所以我们推断,SIA H2可能通过调控ERK途径在乳腺癌中发挥重要的作用,通过将SIA H2作为靶点进而抑制 ERK通路,可为乳腺癌的治疗提供新思路。

[1]Yuan-Yuan Wen,Zhi-Qiang Yang,Min Song,et al.The Expression of SIAH1 Is Downregulated and Associated With Bim and Apoptosis in Human Breast Cancer Tissues and Cells.Molecular car,2010,49:440-449

[2]Della NG,Senior PV,Bowtell DD,et al.Isolation and characterization of murine homologues of the Drosophila seven in absentia gene(sina).Development,1993,117:1333-1343

[3]Hu G,Chung YL,Valentine V,et al.Characterization of human homologs of the Drosophila seven in absentia(sina)gene.Genomics,1997,46:103-111

[4]Nemani M,Linares CG,Bruzzoni GH,et al.Activation of the human homologue of the Drosophila sina gene in apoptosis and tumor suppression.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:9039-9042

[5]Reed J,Ely KR,Degrading liaisons,et al.Siah structure revealed.Nat Struct Biol,2002,9:8-10

[6]Boehm J,He Y,Greiner A,et al.Regulation of BOB.1/OBF.1 stability by SIAH.EMBO,2001,20:4153-4162

[7]Zhang J,Guenther M G,Lazar M,et al.Proteasomal regulation of nuclear receptor corepressor-mediated repression.GenesDev,1998,12:1775-1780

[8]Habelhah H,Frew I,Ronai Z,et al.Stress-induced decrease in TRAF2 stability is mediated by Siah2.EMBO,2002,21:5756-5765

[9]Matsuzawa S,Takayama S,Reed J C,et al.p53-inducible human homologue of Drosophila seven in absentia(Siah)inhibits cell growth:suppression by BAG-1.EMBO,1998,17:2736-2747

[10]Nakayama K,Frew IJ,Hagensen M,et al.Siah2 regulates stability of prolyl-hydroxylases,controls HIF1-alpha abundance and modulates physiological responses tohypoxia.Cell,2004,117:941-952

[11]Holloway AJ,Della NG,Fletcher CF,et al.Chromosomal mapping of five highly conserved murine homologues of the Drosophila RINGfinger gene seven-in-absentia.Genomics,1997,41:160-168

[12]Schmidt RL,Park CH,Ahmed AU,et al.Inhibition of RAS-mediated transformation and tumorigenesis by targeting the downstream E3 ubiquitin ligase seven in absentia homologue.Cancer Res,2007,67:11798-11810

[13]Ahmed AU,Schmidt RL,Park CH,et al.Effect of disrupting seven-in-absentia homolog 2 function on lung cancer cell growth.J Natl Cancer Ins,2008,100:1606-1629

[14]Mc Cubrey JA,Steetman LS,Chappett WH,et a1.Roles of the Rg/MEK/ERK pathway in ceil growth,malignant transformation and drug resistance.Biochim Biophys Acta,2007,1773(8):1263-1284

[15]Widmann C,Gibosn S,Jarpe MB,et a1.Mitogen-activated proteinkinase:con8ervation of a three·kinase module from yeast to human.Physiol Rev,1999,79(1):143-180

[16]Nadeau RJ,Toher JL,Friesel R,et al..Regulation of Sprouty2 stability by mammalian Seven-in-Absentia homolog.Cell Biochem,2007,100:151-160

[17]Jansen MP,Ruigrok-Ritstier K,Dorssers LC,et al.Downregulation of SIAH2,an ubiquitin E3 ligase,is associated with resistance to endocrine therapy in breast cancer.Breast Cancer Res Treat,2008,116:263-71

Expression of SIAH2 and P-ERK in breast cancer and its clinical signif icances

Meng Yuan,Dong Jingyu3,Zhen Juan,Sun Jie,Song Min1,Li Bailin2＊
(University,Shenyang 110001,China;2Department of Chemisry,College of Basic Medical Sciences,china Medical University,Shenyang 110001,China;392 K in 7-system-class,China Medical University,Shenyang 110001,China)

Objective To investigate the expression of SIA H2 and P-ERK in human breast cell lines and breast tissues and their correlation in the malignant progression of breast carcinoma.Methods The expression of SIA H2 and P-ERK was examined in 140 paraffin-embeded specimens using immunohistochemical staining.Human breast cells and 23 cases of breast cancer and pairing non-neoplastic tissue were subjected to Western blot for SIA H2 and P-ERK proteins.The expression of P-ERK in SIA H2 siRNA transfected cells was examined by Western blot.Results The expression of SIA H2 and P-ERK was gradually increased in the mabignant progression of breast carcinoma.Western blot analysis showed that the expression of SIA H2 and P-ERK proteins were higher in breast cancer tissues and breast cancer cells than in the adjacent normal breast tissues and normal breast cells.Western blot anaysis also showed that,compared with that of the control cells,the expression of P-ERK in SIA H2 siRNA-transfected cells was significantly decreased.Conclusion The results strongly suggest that SIA H2 and P-ERK are both over expression in human breast cancer.When the expression of SIA H2 was decreased the expression of P-ERK was also decreased.So we conclude that loss or reduction of SIA H2 expression would suppress the expression of PERK in breast cancer cells,which would inhibit tumor cell growth.

Breast carcinoma; SIA H2; P-ERK; Clinicopathological factors; Interference

R737.9

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.004

2010-02-10

2011-04-01

辽宁省教育厅科研基金资助项目(2008739)

孟媛,女(1980年),汉族,硕士研究生。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)