肝组织中 NF-κB、TGF-β1及其 Ⅰ型受体 mRNA和 HSC在肝纤维化中的改变及护肝片对其的影响

吴义春 吴 强 杨 雁 杨 枫 陈敏珠

肝组织中 NF-κB、TGF-β1及其 Ⅰ型受体 mRNA和 HSC在肝纤维化中的改变及护肝片对其的影响

吴义春＊吴 强＊1杨 雁1杨 枫1陈敏珠1

(安徽医学高等专科学校病理学教研室合肥230601;1安徽医科大学病理学教研室合肥230022)

目的 探讨中、晚期纤维化大鼠肝组织中肝星状细胞(HSC)的活化与增殖、核转录因子-κB(NF-κB)及转化生长因子-β1(TGF-β1)及其Ⅰ型受体(TβRⅠ)表达的改变及护肝片对其的影响。方法 采用12.5%CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型,自造模之日起,大鼠分组灌胃给药(护肝片921mg/kg)或溶媒,每日一次,直至8或13周末,分别处死动物,取左叶肝组织石蜡包埋,制作组织芯片。免疫组化S-P法检测大鼠肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和NF-κB p65蛋白的表达,原位杂交检测 TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表达;并用MetaMorph图像分析系统计数α-SMA阳性细胞数,对NF-κB p65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达量进行定量分析。结果 1.模型复制8周和13周,模型组的肝损伤及其纤维化分级均明显高于正常组(P<0.01),护肝片组的肝损伤及其纤维化分级均轻于模型组。2.模型复制8周和13周,模型组活化的 HSC(即α-SMA阳性细胞)数量较正常组明显增多,NF-κB p65蛋白、TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表达均较正常组明显增强(P<0.01);3.护肝片显著抑制8、13周纤维化肝组织 HSC的活化与增殖和NF-κB p65蛋白、TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表达(P<0.01)。结论 抑制 HSC的活化与增殖和NF-κB p65蛋白与 TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表达可能是护肝片抗肝纤维化作用的靶点之一。

肝纤维化; 护肝片; 肝星状细胞; 核转录因子-κB; 转化生长因子-β1; 转化生长因子-βRⅠ;免疫组化; 原位杂交; 组织芯片

肝纤维化是肝脏受到慢性损伤时的一种修复反应,是慢性肝病发展至肝硬化的必经阶段,其主要特征是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成与降解失衡,导致ECM在窦周间隙的大量沉积。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)是肝纤维化时ECM过多产生和沉积的主要细胞来源,HSC的激活、增殖及 ECM的过量沉积在肝纤维化过程中起核心作用[1,2]。核转录因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)是一种具有转录激活功能的蛋白质,普遍存在于多种组织的多种细胞中。体外研究发现NF-κB可能参与调控了肝纤维化过程中的枯否氏细胞(Kupffer cells,KC)和肝星状细胞的活化[3-4]。转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)是强有力的致纤维化的细胞因子,促进HSC增殖活化,在纤维化进程中起重要作用[5]。护肝片抑制纤维化肝组织 TGF-β1及 TβRⅠ蛋白的表达[2],为此,本研究拟就护肝片对中晚期纤维化大鼠肝组织 HSC与 NF-κB、TGF-β1及 TβR ⅠmRNA 表达的影响进行观察,进一步探讨其抗肝纤维化作用机制。

材料和方法

1.动物模型的建立和肝组织的处理

SD大鼠54只,雌雄兼用,体重150-180g,由上海西普尔-必凯实验动物中心提供(清洁级),标准饲料,自由饮水。随机分成两大组:模型复制8与13周,均各设正常组、模型组和护肝片(921mg/kg)组。自模型复制之日起,除正常组外,各组大鼠按100g体重0.5ml背部皮下注射10﹪CCl4精制花生油溶液,每周2次[6],分别连续8与13周。灌胃(ig)给药,每天1次,正常组与模型组ig等容量5g/l羟甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液,直至8周或13周。分别在实验的第8、13周末处死动物,取左叶肝组织常规10﹪甲醛溶液固定,石蜡包埋,4μm连续切片,HE染色,光镜观察。

2.组织芯片制作

HE染色切片在光镜下用定位器定位后,通过打孔、定位、取样、点样,从供体蜡块中的相应部位采集目标组织整齐包埋于受体蜡块中,制成组织片直径为1mm、间隔1mm的组织芯片。4μm连续切片,贴附于经10﹪多聚赖氨酸防脱片预处理的载玻片上,分别作苏木精-伊红(HE)染色、网状纤维染色、Van Gieson(V G)胶原纤维染色、免疫组织化学染色和原位分子杂交。

3.免疫组化 S-P法检测α-SMA、NF-κB蛋白的表达

采用柠檬酸钠缓冲液热抗原修复,S-P法免疫组织化学染色,用DAB/H202显色,苏木精复染。羊抗Actin(Ⅰ-19)、兔抗 NF-κB p65多克隆抗体均购于Santa Cruz,兔S-P法(Second Generation LABSA)Kits试剂盒为美国Zymed公司产品。具体操作遵试剂盒说明书,用已知阳性切片作为阳性对照,用PBS代替一抗作为阴性对照。

4.原位杂交检测 TGF-β1及 TβRⅠmRNA 的表达

TGF-β1及 TβRⅠ的寡核苷酸探针均经地高辛标记,显色系统为生物素化鼠抗地高辛和过氧化物酶标记链霉卵白素(SABC),DAB显色。针对TGF-β1靶基因的 mRNA 的探针序列为:(1)5′-ACCTG CAA GA CTA TC GACA T GGA GC TGGTG-3′;(2)5′-TGTAC AACA G CACCC GCGAC CGGGT GGCCG-3′;(3)5′-GTACC A GAAA TACA G CAACA A TTCC TGGCG-3′。针对 TβRⅠ靶基因的 mRNA的探针序列为:(1)5′-TA GCT GAAA T TGACT TAA TT CCTCG A GA TA-3′;(2)5′-GTGTC A GA TT A TCA T GA GCA TGGA T CCCTT-3′;(3)5′-GTA TGCCAA T GGA GC A GCTA GGCTT ACA GC-3′。TGF-β1及 TβR Ⅰ的原位杂交检测试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。具体操作遵试剂盒说明书,用已知阳性切片作为阳性对照,用预杂交液代替杂交液作阴性对照。

5.定量分析

肝纤维化病理学分级为0-Ⅵ级[7]。α-SMA免疫组化染色以细胞质中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性,200倍光镜下任选3个250μm×250μm范围计数α-SMA阳性细胞来判断结果。NF-κB以细胞浆和∕或细胞核内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性;TGF-β1及 TβRⅠmRNA 的原位杂交染色结果,以胞浆内或胞膜上出现棕黄色颗粒为阳性。Eclip se E800型光学显微镜(日本Nikon)(×400)下任选取3个视野用Spot Advanced显微摄像系统(美国Diagnostic Instruments Inc)拍摄照片,用 4.01版MetaMorp h图像分析系统(美国Universal Imaging公司)进行显微定量分析,分析每个组织片上NF-κB 蛋白、TGF-β1及 TβR ⅠmRNA 的平均灰度值(Average gray value,A GV)和平均光密度值(Mean optical density,MOD)。

6.统计学处理

运用SPSS(11.0 for windows)软件对数据进行统计学处理。计量资料间比较采用t检验和one way ANOVA检验。

结 果

1.护肝片对CCl4性纤维化大鼠肝脏病理学改变的影响

HE、网状纤维及V G胶原纤维染色结果见表1。正常组肝小叶结构完整,肝细胞排列整齐,无炎细胞浸润,模型组大鼠在模型复制8、13周均可见肝细胞脂肪变性、水变性和点状坏死、碎片状坏死,13周时胶原纤维增生形成完整的纤维间隔,并分割肝小叶形成假小叶,纤维间隔内可见慢性炎细胞浸润。在模型复制8、13周,护肝片组肝细胞的水变性、脂肪变性、炎细胞浸润及纤维组织增生均轻于模型组。模型复制8、13周,正常组与模型组肝纤维化分级比较,差异有显著性(P<0.01)。

表1 大鼠CCl4性肝纤维化8、13周的病理学分级(单位:只)Table 1 Fibrosis grades of carbon tetrachloride-induced fibrotic liver in rats during 8 and 13 weeks(unit:number)

2.α-SMA阳性细胞在正常及纤维化大鼠肝组织中的分布及护肝片对其数量的影响

HE染色结合免疫组化染色结果观察显示,α-SMA阳性细胞位于窦周Disse间隙,形态不规则,胞体呈卵圆形或不规则。正常组、模型组及护肝片组肝组织中均有α-SMA阳性细胞,但其数量明显的不同(表2)。大鼠CCl4性肝纤维化8周、13周,模型组α-SMA阳性细胞数均明显高于正常组,且模型组的α-SMA阳性细胞数8周明显高于13周。大鼠CCl4性肝纤维化 8周、13周,护肝片组肝组织α-SMA阳性细胞数量均显著低于模型组。

3.NF-κB p65蛋白在 CCl4性纤维化大鼠肝脏组织和细胞中的分布及护肝片对其表达的影响

正常对照组大鼠肝组织较少表达NF-κB p65蛋白(图1,图4),模型组大鼠肝组织则有较强的NF-κB p65蛋白表达,分布在细胞浆、细胞核中(图2,图5)。NF-κB p65蛋白的阳性染色分布于纤维化区、肝窦壁、血管壁及部分胆管细胞,脂肪变性和水变性的肝细胞也可见阳性染色。表3显示,大鼠CCl4性肝纤维化8、13周,模型组肝组织NF-κB p65蛋白的表达量显著高于正常组。模型组肝组织NF-κB p65蛋白的表达量8、13周相比差异无显著性。大鼠CCl4性肝纤维化8、13周,护肝片(图3,图6)显著地抑制纤维化肝组织 NF-κB p65蛋白的表达(P<0.01)。

表2 护肝片对CCl4所致纤维化大鼠肝组织α-SMA阳性细胞数量的影响(单位:个)Table 2 Effect of Liver-aid tablets on the number of α-SMA positive cells in carbon tetrachloride-induced fibrotic liver tissue(unit:number)

表3 护肝片对CCl4所致纤维化大鼠肝组织NF-κB p65蛋白表达量的影响Table 3 Effect of Liver-Aid tablets on expression of NF-κB p65 protein in carbon tetrachloride-induced hepatofibrotic rats

4.TGF-β1及 TβR Ⅰ的 mRNA 在 CCl4性纤维化大鼠肝脏组织和细胞中的分布及护肝片对其的影响 正常肝组织不表达或仅微弱表达 TGF-β1及TβRⅠmRNA,它们分布于胞质和∕或胞核内(图7,图 10,图 13,图 16);模型组 (图 8,图 11,图 14,图17)和护肝片(图 9,图 12,图 15,图 18)组肝组织均有较强的 TGF-β1及 TβRⅠmRNA 表达,主要分布在细胞质及细胞核上。TGF-β1及 TβRⅠmRNA的阳性染色分布于变性的肝细胞、纤维化区、肝窦壁、血管壁及部分胆管细胞。表4显示,大鼠CCl4性肝纤维化8周、13周,模型组肝组织 TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表达量均显著高于正常组。模型组肝组织,TGF-β1mRNA的表达量13周显著高于8周,TβRⅠmRNA的表达量8周显著高于13周。大鼠CCl4性肝纤维化8周、13周 ,护肝片组肝组织 TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表达量均显著低于模型组,但仍显著高于正常组。

表4 Liver-Aid tablets对CCl4所致纤维化大鼠肝组织 TGF-β1 mRNA、TβRⅠmRNA表达量的影响Table 4 Effect of Liver-Aid tablets on mRNA expression of TGF-β1 and TβR Ⅰin carbon tetrachloride-induced hepatofibrotic rats

表5 造模8、13周正常组、模型组、Liver-Aid tablets组各数据间的相关系数Table 5 The correlation coefficient of data of normal group,model group,Liver-Aid tablets group between to each other during 8 and 13 weeks

5.相关分析

表5显示,大鼠CCl4性肝纤维化8周,正常组、模型组及护肝片组大鼠肝组织的α-SMA阳性细胞数、NF-κB p65 蛋白、TGF-β1及 TβR ⅠmRNA 表达量相互间均呈显著正相关。大鼠CCl4性肝纤维化13周,除α-SMA阳性细胞数与 TβRⅠmRNA表达量之间不相关之外,其余各数据之间均呈显著正相关。

讨 论

中药护肝片(黑龙江葵花药业股份有限公司)是糖衣片,由柴胡、茵陈、板蓝根、五味子、猪胆粉、绿豆组成,有抗肝纤维化作用。本模型采用12.5%CCl4致大鼠肝纤维化的一般病理学改变结果显示,造模8、13周,模型组肝组织正常肝小叶结构被破坏消失,汇管区和中央静脉区胶原纤维增生,分割肝小叶形成大方形及小方形假小叶,模型组的肝损伤及其纤维化分级均显著高于正常组,表明CCl4致大鼠肝纤维化造模成功。8、13周模型组肝损伤的病理组织学变化及纤维化分级间无明显差异,但13周较8周有发展加重趋势,这与8周肝纤维化已经形成,而晚期(13周)肝纤维化可能处于相对稳定状态、胶原的合成与降解达到新的平衡有关。护肝片组的肝损伤及其纤维化分级均轻于模型组,进一步证实护肝片对大鼠CCl4慢性肝损伤及其纤维化形成有抑制作用[2]。

肝纤维化是肝脏对各种损伤的修复反应,在肝脏炎症损伤过程申,HSC活化发生表型转变而具有肌成纤维细胞(MFB)的特性,使 ECM-胶原蛋白合成增加,细胞收缩性增强,在肝纤维化的形成中发挥关键作用,HSC活化是肝纤维化形成过程的中心环节[8],α-SMA是其活化的标志[9]。本实验用12.5%CCl4致大鼠慢性肝损伤,α-SMA染色结果显示,造模8、13周,模型组肝组织活化的 HSC(即α-SMA阳性细胞)数量均较正常组显著增多,这与文献报道一致。证实在肝纤维化过程中活化的 HSC数量增多,即 HSC被活化并大量增殖。在大鼠CCl4性肝纤维化8、13周时,模型组有明显的肝纤维化形成,表明HSC的活化、增殖与ECM的沉积的现象是一致的,两者关系密切。本次实验中,出现13周模型组活化的HSC数量较8周显著减少这一有趣的现象,对这一现象的解释目前尚无文献报道,我们推测可能是由于晚期肝纤维化已处于相对稳定状态,胶原的合成与降解处新的平衡所致,有待于进一步研究。大鼠CCl4性肝纤维化8周,活化的HSC数量与NF-κB p65 蛋白、TGF-β1及 TβR ⅠmRNA 的表达均呈显著正相关;13周活化的 HSC数量也与NF-κB p65蛋白、TGF-β1mRNA的表达呈显著正相关;8、13周,护肝片组肝组织活化的 HSC数量均较模型组显著减少,提示:①肝纤维化时 HSC的活化、增殖与 NF-κB p65 蛋白、TGF-β1及 TβR ⅠmRNA 的表达有关;②护肝片的抗肝纤维化作用机制之一可能是抑制纤维化肝组织HSC的活化与增殖。

目前共克隆得到5种 TGF-β异构体,命名为TGF-β1-5,在哺乳动物仅有 TGF-β1-3[10]。在肝脏TGF-β1是各种 TGF-β异构体中最主要的存在形式,TGF-β1含量较 TGF-β2、TGF-β3高约 10 倍 ,TGF-β1是强有力的致纤维化的细胞因子,在肝纤维化时表达明显增多,促进 HSC增殖活化,合成大量 ECM,在纤维化进程中起重要作用[5]。TGF-β1是肝纤维化主要的始动因子之一,研究证实肝纤维化时其表达增加[11]。TGF-β产生时均以非活性状态存在,与相应受体无结合活性。肝受损时,肝内的炎症细胞、HSC、KC等自分泌或旁分泌非活性 TGF-β1,非活性 TGF-β1被炎症环境中的各种酶和细胞因子激活,刺激上述细胞进一步产生 TGF-β1,形成逐级放大效应 ,导致 TGF-β1大量生成和激活。活性 TGF-β1通过与细胞膜上的受体结合而发挥作用,参与信号转导。TGF-β以自分泌和旁分泌方式参与 HSC的活化[5,12],促进 HSC合成各种胶原成分以及组织金属蛋白抑制剂(TIM Ps),同时能够抑制基质金属蛋白酶(NMPs)的合成,引起ECM积聚而导致肝纤维化的发生[13]。研究表明护肝片抑制纤维化大鼠肝组织 TGF-β1及 TβRⅠ的蛋白的表达[2],试验结果显示,在CCl4性大鼠肝纤维化中晚期,肝组织中 TGF-β1及 TβRⅠ的mRNA的表达均呈明显一致性增多,表明在肝纤维化过程中,TGF-β1及 TβRⅠ表达增加是由于其转录水平增加所致,且 TGF-β1与 TβRⅠ在肝纤维化过程中有协同作用,在中晚期肝纤维化中起重要作用;模型组肝组织,TGF-β1mRNA的表达量13周显著高于8周,TβRⅠmRNA的表达量8周显著高于13周,护肝片在mRNA水平上抑制中晚期纤维化肝组织 TGF-β1及 TβRⅠ的表达,提示在肝纤维化不同时期,上述靶点的反应性有所差异,可能受到多种因素的影响,其机制有待进一步研究;抑制TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表达是护肝片抗肝纤维化的作用靶点之一。

TGF-β1的合成受核转录因子的调控,目前发现的核转录因子主要有NF-κB、AP-1等。NF-κB在哺乳动物中最多见的是由p65和p50组成的异源二聚体。细胞处于静息状态时,NF-κB位于细胞质,其p65亚基与抑制蛋白(Inhibitory kappa B,IκB)单体结合,覆盖p50的核定位信号,使NF-κB与IκB以三聚体失活状态存在于细胞质中。当机体受到外界因素刺激时,IκB发生磷酸化,并从NF-κB二聚体上解离,暴露p50的核定位信号,NF-κB得以激活并移位进入细胞核促进靶基因转录。TGF-β1活化因子组织转谷氨酰酶(t TG)基因的启动子中含有NF-κB的结合位点,因而 NF-κB能促进 TGF-β1表达。本试验结果显示,与正常组相比,8、13周模型组大鼠肝脏组织NF-κB p65蛋白表达明显增强,而且8、13周NF-κB p65蛋白与 TGF-β1及 TβR ⅠmRNA 表达呈显著正相关,提示 NF-κB参与肝纤维化反应,促进肝纤维化形成;肝纤维化过程中,NF-κB可能在介导TGF-β1的活化或产生中发挥一定的作用[14],NF-κB也可能还进一步在介导 TβRⅠ的活化或产生中发挥一定的作用,有待进一步探讨。本实验结果还显示,大鼠CCl4性肝纤维化8、13周,NF-κB p65蛋白的表达与活化的 HSC数量呈正相关,提示 NF-κB参与肝纤维化的发生发展,其机制之一是 NF-κB参与HSC的活化与增殖。大鼠 CCl4性肝纤维化8、13周,护肝片组肝组织NF-κBp65蛋白表达均较模型组显著减少,提示:①NF-κB可能是护肝片抗肝纤维化作用靶点之一;②护肝片可能通过抑制纤维化肝组织NF-κB的表达从而影响 TGF-β1和 TβRⅠ的表达;③护肝片可能通过抑制纤维化肝组织NF-κB的表达,进而导致纤维化肝组织活化的 HSC数量减少。

组织芯片(tissue chip)又称组织微阵列(tissue microarray),是将几十个甚至几百个组织按预先设计的要求在某一载体上排列成矩阵的微缩组织切片。它具有平行、高通量对组织进行分析研究,节约组织原材料和检测试剂,并因实验条件一致,从而减少实验误差[15]。本研究制作了低密度肝组织芯片,直径1mm的组织芯片包涵了3-5个肝小叶范围,能充分展现肝纤维化的病理形态学改变。在组织芯片上做了 HE染色、网状纤维染色、V G胶原纤维染色、免疫组化和原位杂交,既节约试剂成本、减轻实验强度,又减少了实验误差,提高了不同组织之间染色结果的可比性。制作组织芯片过程中用定位器进行定位,使所取得的组织片具有代表性,收到较好效果,为中药抗肝纤维化的研究提供了新的思路。

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图 版 说 明

图1 8wk正常组肝组织的NF-κB p65蛋白表达。×400

图2 8wk模型组肝组织的NF-κB p65蛋白表达。×400

图3 8wk护肝片组肝组织的NF-κB p65蛋白表达。×400

图4 13wk正常组肝组织的NF-κB p65蛋白表达。×400

图5 13wk模型组肝组织的NF-κB p65蛋白表达。×400

图6 13wk护肝片组肝组织的NF-κB p65蛋白表达。×400

图7 8wk正常组肝组织的 TGF-β1mRNA表达。×400

图8 8wk模型组肝组织的 TGF-β1mRNA表达。×400

图9 8wk护肝片组肝组织的 TGF-β1mRNA表达。×400

图10 13wk正常组肝组织的 TGF-β1mRNA表达。×400

图11 13wk模型组肝组织的 TGF-β1mRNA表达。×400

图12 13wk护肝片组肝组织的 TGF-β1mRNA表达。×400

图13 8wk正常组肝组织的 TβRⅠmRNA表达。×400

图14 8wk模型组肝组织的 TβRⅠmRNA表达。×400

图15 8wk护肝片组肝组织的 TβRⅠmRNA表达。×400

图16 13wk正常组肝组织的 TβRⅠmRNA表达。×400

图17 13wk模型组肝组织的 TβRⅠmRNA表达。×400

图18 13wk护肝片组肝组织的 TβRⅠmRNA表达。×400

EXPLANATIONOF FIGURES

Fig.1 NF-κB p65 protein expression ofhepatic tissue in the normal group during 8 weeks.Immunohistochemiscal staining×400

Fig.2 NF-κB p65 protein expression ofhepatic tissue in the model group during 8 weeks.Immunohistochemiscal staining×400

Fig.3 NF-κB p65 protein expression ofhepatic tissue in the liver-aid tablets(921mg kg d-)administration group during 8 weeks.Immunohistochemiscal staining×400

Fig.4 NF-κB p65 protein expression ofhepatic tissue in the normal group during 13 weeks.Immunohistochemiscal staining×400

Fig.5 NF-κB p65 protein expression ofhepatic tissue in the model group during 13 weeks.Immunohistochemiscal staining×400

Fig.6 NF-κB p65 protein expression ofhepatic tissue in the liver-aid tablets(921mg kg d-)administration group during 13 weeks.Immunohistochemiscal staining ×400

Fig.7 TGF-β1mRNA expression of hepatic tissue in the normal group during 8 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.8 TGF-β1mRNA expression of hepatic tissue in the model group during 8 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.9 TGF-β1mRNA expression of hepatic tissue in the liver-aid tablets(921mg kg d-)administration group during 8 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.1 0 TGF-β1mRNA expression of hepatic tissue in the normal group during 13 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.1 1 TGF-β1mRNA expression of hepatic tissue in the model group during 13 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.1 2 TGF-β1mRNA expression of hepatic tissue in the liver-aid tablets(921mg kg d-)administration group during 13 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.1 3 TβRⅠmRNA expression of hepatic tissue in the normal group during 8 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.1 4 TβR ⅠmRNA expression of hepatic tissue in the model group during 8 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.1 5 TβRⅠmRNA expression of hepatic tissue in the liver-aid tablets(921mg kg d-)administration group during 8 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.1 6 TβRⅠmRNA expression of hepatic tissue in the normal group during 13 weeks. Hybridization in situ staining×400

Fig.1 7 TβR Ⅰ mRNA expression of hepatic tissue in the model group during 13 weeks.Hybridization in situ staining×400

Fig.1 8 TβRⅠmRNA expression of hepatic tissue in the liveraid tablets(921mg kg d-)administration group during 13 weeks.Hybridization in situ staining×400

Altered protein expression of NF-κBand mRNA expression of TGF-β1 and its type Ⅰreceptor and HSCs of hepatic tissue in the middleand late stage of rat hepatic fibrosisand the effect of liver-aid tabletson them

Wu Yichun＊,Wu Qiang＊1,Yang Yan1,Yang Feng1,Chen Minzhu1
(Dapartment of Pathology Anhui Medical College,Hef ei,Anhui,230601;1Department of Pathology Anhui Medical University,Hef ei,Anhui 230032,China)

Objective To study the effect of Liver-aid tablets on the activation and proliferation of hepatic stellate cells(HSCs)and protein expression of Nf kappaB(NF-κB)and mRNA expression of transforming growth factor beta-1(TGF-β1)and its type Ⅰreceptor(TβR Ⅰ)in the middle and late stage of rat hepatic fibrosis.Methods SD rats were divided into 3 group s:normal control,model control and group of Liver-aid tablets.CCl4(12.5%,4ml·kg-1)was injected subcutaneously in model rats twice a week for 8 and 13 weeks.The drug(921mg·kg-1in the group of Liver-aid tablets,but 0.5%CMC-Na in control groups)was given intragastrically once a day for 8 and 13 weeks.The rats were killed at the end of 8th and 13th week respectively,the left liver tissue was then used to make tissue microarrays(TMA)..IHC S-P method was used to detect the protein expression ofα-smooth muscle actin(α-SMA)and NF-κB p65,while the mRNA expression of TGF-β1and TRβ Ⅰwas detected by ISH.α-SMA positive cells were counted in three random 250μm ×250μm areas under light microscop(×200).The expression of NF-κB protein,TGF-β1and TβRⅠmRNA were quantified by MetaMorp h imaging analysis system.Results 1.Afeter 8 and 13 weeks,the degreesof liver injury and fibrosis grades in the model group were higher than those in the normal group(P<0.01),which was ameliorated remarkably by Liver-aid tablets.2.The number of activated HSCs in fibrotic model liver tissue was more than that in the normal group after 8 and 13 weeks(P<0.01).The protein expression of NF-κB,and the mRNA expression of TGF-β1and TβR Ⅰin the model group were stronger than those in the normal group after 8 and 13 weeks(P<0.01).3.Liver-aid tablets inhibited not only the activation and proliferation of HSCs,but also the protein expression of NF-κB and mRNA expression of TGF-β1and TβR Ⅰof fibrotic liver tissue after 8 and 13 weeks(P<0.01).Conclusion Liver-aid tablets have anti-fibrosis effects on CCl4-induced rat liver fibrosis,which might be performed through the pathway of inhibiting the activation and proliferation of HSCs,the protein expression of NF-κB,and the mRNA expression of TGF-β1and TβR Ⅰ.

Hepatic fibrosis; Liver-aid tablets; HSC; NF-κB; TGF-β1; TGF-βR Ⅰ;Immunohistochemistry; In situ hybridization; Tissue microarrays

R322.47 R285.5

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.003

2010-12-14

2011-04-01

安徽省自然科学研究基金(99044126);安徽省教育厅自然科学研究重点项目(2006KJ092A)

吴义春,男(1973年),汉族,副教授。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)