表皮干细胞在组织修复中应用的研究进展

张苗苗 付倩倩 赵雅玫 周军利 余小平

（1.甘肃中医药大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000；2.宁夏医科大学临床医学院，宁夏 银川 750000；3.甘肃省人民医院烧伤科，甘肃 兰州 730000）

皮肤是人体最大的器官和第一道免疫屏障，具有抵御病原体入侵、调节体温、提供感觉等多种重要功能[1]。创面愈合是一个复杂且受到高度调控的过程，关系到组织的完整性和功能的恢复[2]。大面积烧伤、压力性溃疡等严重和广泛的皮肤损伤以及糖尿病等疾病损害皮肤的再生能力，会导致局部细胞增殖异常、生长因子及干细胞减少，发生表皮再生障碍[3]。随着糖尿病、血管性疾病和肥胖患者的日益增多，慢性创面发生率增加，但由于慢性创面治疗策略有限，治疗效果不理想，需要消耗大量医疗资源，医疗费用昂贵，使慢性创面正成为一个重大的全球问题[4-5]。皮肤及其附件中存在着不同类型的干细胞，它们在维持皮肤稳态、调节生理条件下的皮肤损伤过程中发挥着重要的作用。表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)作为表皮层基底部的细胞参与了创面修复的过程。ESCs具有数量众多且与胚胎干细胞相比容易获得、不存在潜在的伦理学问题等优势，因此，采用移植ESCs的方法进行创面修复具有良好的临床应用前景[6-7]。自20世纪70年代以来，研究人员一直探索利用ESCs进行组织再生的方法，部分方法已被证明可以促进创面愈合或替代不可逆丢失的皮肤，比如，ESCs、间充质干细胞和脂肪源性干细胞结合丝质支架及ESCs与生物材料相结合的先进生物工程皮肤移植可以有效地促进皮肤创伤的修复和再生[8]。ESCs可以作为种子细胞是其用于各类皮肤退行性病变及皮肤再生研究的基础和重点，其可在体外培养和所具有的增殖潜力使其成为皮肤生物工程的首选细胞。本文对ESCs的特点、在创面愈合过程中的作用机制以及ESCs在组织修复中应用的研究进展综述如下，探讨ESCs在临床应用中的潜力和可行性。

1 ESCs的位置及标记

在皮肤表皮中存在多种干细胞，其中ESCs在表皮形成、表皮组织结构稳定和皮肤创伤愈合等方面发挥重要作用。ESCs类型包括毛囊间表皮干细胞（interfollicular epidermal stem cells, IFESCs）、毛囊干细胞（hair follicle stem cells，HFSCs）等。ESCs所处的特定微环境被称为干细胞生态位，即干细胞的微环境，是控制干细胞增殖、分化和迁移的基础[9-11]。在皮肤中已发现了3种不同的ESCs生态位，包括表皮基底层、毛囊隆突部和皮脂腺的基部[12]。位于不同生态位的ESCs有不同的生物标记物和功能，IFESCs位于滤泡间表皮（interfollicular epidermis，IFE）的基底层，并分化产生基底层细胞,高水平表达β1-整合素（CD34）和α6-整合素、富含leu的重复序列和免疫球蛋白样结构域（LRIG）1以及黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖；IFESCs不仅补充基底层，还产生非增殖的、具有转录活性的棘状层和颗粒层，最后形成终末分化角质层的外层[13]。HFSCs位于毛囊外根鞘的隆突部并具有特异性膨大标志物，如CD34、LGR5和转录因子-3。毛囊的隆突部是角质形成细胞和毛囊细胞的来源。这些干细胞能够再生包括毛发、皮脂腺和毛囊等许多皮肤结构，特异性细胞标志物有CD34、角蛋白15（cytokeratin，K15）、SRY-box（Sox）9等。

2 ESCs的特性

2.1 ESCs的可塑性 ESCs表现出相当大的分化潜能，具有可以在不同环境下转化或分化为其他类型细胞的能力，被定义为可塑性[14]。皮肤损伤后IFESCs和HFSCs被招募到滤泡间表皮中时，它们逐渐失去最初的特性，分化为IFE；长寿命的IFESCs可以被招募到创面并促进创面的再上皮化。除IFESCs外，皮肤损伤后HFSCs也表现出可塑性，隆突部和漏斗部的HFSCs向上迁移、增殖并参与表皮修复过程，迁移的HFSCs逐渐失去其原来的特性，并采用IFE分化程序。然而，HFSCs在IFE中不能长时间存活，分化的基底层以上表皮细胞在受伤时可以去分化为干细胞。在创面愈合过程中，GATA6阳性细胞被动员，迁移到受伤的IFE，并从分化后的细胞去分化为干细胞，并获得干细胞特性[14]。在毛囊中也观察到了去分化现象。皮肤损伤后，隆突部位的HFSCs消失，已分化的漏斗部细胞或皮脂腺细胞可以重新填充干细胞生态位，并成为功能性HFSCs。干细胞可以产生分化细胞，也通过对称或不对称分裂来繁殖以维持恒定的干细胞池[15]。

2.2 ESCs的自我更新、动态增殖和迁移 在创面愈合过程中，ESCs通过增强对称更新或减少分化细胞的比例实现组织更新。在胚胎发育过程中，大多数的基底细胞分裂是对称的（由一个干细胞产生两个相同的子细胞，表现出分化的表型），并平行于基底膜的轴，维持胚胎表皮的生长和确保上皮保持单层。而在成年后处于内稳态的基底细胞在上皮分层过程中，约70%的基底细胞的分裂是不对称的（一个子细胞失去与基膜分泌的整合素和生长因子的接触而发生分化，第二个子细胞保持与基膜的接触而保持干细胞的特征）[16]，从而允许基底层细胞的发育和表皮的建立。创面愈合过程中可见角化细胞增殖增加，然而，细胞增殖只能在离创面边缘0.5～1.5 mm的增殖区检测到，而不能在创面边缘检测到；在创面边缘，位于基底层和基底上层细胞以细胞薄片（伤口周围的上皮组织在靠近伤口的地方形成一个迁移前沿，远端被增殖细胞的同心圆包围）的形式迁移[17-18]。细胞的增殖可以促进产生多余的细胞，随后迁移到创面中心修复组织[19]。

3 ESCs的信号调节机制

ESCs可对多个信号系统的激活和抑制做出反应。ESCs相关信号通路中的Wnt和Notch信号通路对ESCs“生态位”发挥着关键作用[20-21]。当皮肤损伤时，在Wnt和Notch信号通路的调控下，干细胞生态位在细胞因子产生、参与细胞信号传递、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）改变等方面发生变化[22]。典型的Wnt通路通过抑制糖原合成酶激酶3β发挥作用，导致未磷酸化的catenin积累，随后catenin作为DNA结合蛋白的淋巴增强子结合因子1/转录因子家族的核辅因子[23]，促进关键微管结合蛋白的积累，这些蛋白在活性状态下稳定创面边缘细胞的微管，从而促进创面修复。研究发现，Wnt和Notch信号的激活或抑制可通过靶向原癌基因Myc、碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子(c-Myc)和Hes1影响ESCs的增殖、角质形成细胞的分化和迁移以及毛囊再生，最终导致创面愈合增强或延迟；若调节功能失控则会导致皮肤衰老或者肿瘤发生。另外，可通过吸引和排斥双重机制对轴突生长和细胞迁移发挥导向功能的轴突导向因子Nertrin-1蛋白可通过调节ESCs功能，减轻紫外线B辐射诱导的氧化应激，改善线粒体功能障碍，减轻长期暴露于紫外线造成的皮肤损伤[24-25]。

ESCs的信号调节，既是ESCs发挥各种潜能的内在机制，也是全面认识ESCs特性及挖掘ESCs转化应用的关键环节，有待于深入探讨研究。

4 ESCs在组织修复中的应用

4.1 ESCs在烧伤创面修复中的应用 由于皮肤及其附件中存在多种干细胞类型，皮肤显示出较强的修复潜力。研究表明，位于毛囊隆突部的干细胞是皮肤组织更新和创面修复的新细胞的重要来源[26]。ESCs可以完成理想的自我更新而形成新的表皮，并保持对局部信号的时空响应能力[27]。以ESCs为主体的烧伤创面的自体表皮移植物（cultured epidermal autografts ，CEAs）已经取得了良好的效果，并且CEA植入成功与否与ESCs含量的高低有关[8]。因此，通过富集ESCs可以促进皮肤替代物和CEAs的移植。还有研究显示，在人α-防御素-5诱导的小鼠Ⅲ度烧伤模型中，毛囊膨出部的ESCs的激活加速了创面愈合，重要的是还诱导了毛发再生[28]，提示这种方法可能成为治疗重度烧伤的新方法。同样，通过荧光激活细胞分选分离的富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体6（lgr6）阳性ESCs移植并注射到伤口中，可显著促进再上皮化、毛发生长和血管生成。目前，采用表皮细胞悬液移植（主要移植ESCs）与刃厚皮网状移植技术相结合，在缓解烧伤患者疼痛、减少供区损伤、降低住院费用及缩短住院时间方面具有优势[29-30]；在治疗大面积烧伤时，表皮细胞悬液还可以同富血小板纤维蛋白、富血小板血浆或富血小板白细胞凝胶结合或作为自体刃厚皮移植的辅助治疗方案[14,31]，可以取得更加理想的疗效。此外，通过使用模拟生态位力学特性的载体基质，可以提高ESCs的性能，提供正常的生理环境，优化ESCs的再生功能[8]。

4.2 ESCs在慢性创面修复中的应用 随着糖尿病、肥胖、血管性疾病和人口老龄化的增加，慢性创面患者也在增加。由于慢性创面的发病机制复杂，许多皮肤替代物和移植物治疗已被证明无效。糖尿病创面存在高度蛋白水解的微环境，基质金属蛋白酶的持续升高导致ECM降解、炎症失调和创面闭合障碍[28]。聂刚等[32]探讨了高浓度葡萄糖对小鼠ESCs增殖的影响，研究结果表明，高浓度葡萄糖可明显抑制小鼠ESCs 的增殖。此外，慢性创面还会导致创面ESCs数量的减少，这些ESCs会因细胞增殖的增加导致被大量消耗而减少，并且由于微环境异常而导致表皮无法再生[14]。然而，如果在与ECM具有生物相容性的底物上富集ESCs制备CEAs，再将其移植到慢性创面上，上述负循环可能会被打破，不仅可以解决ESCs减少的问题，还能提供ECM成分来稳定创面微环境。此外，有研究通过离散数量的基因校正ESCs再生了功能表皮，促进了难愈性皮肤溃疡的修复[33-35]。

4.3 ESCs在尿道再生中的应用 在动物模型中采用干细胞治疗膀胱功能障碍、压力性尿失禁、勃起功能障碍和尿道损伤已经取得了令人鼓舞的结果。皮肤移植已经成为尿道再生的一种方法，如口腔黏膜尿道成形术，形成的尿道组织适应有尿液暴露的湿润环境，具有较高的机械强度，并能通过伤口床的供血迅速实现血管化；缺点是可供采集的口腔黏膜数量有限，可能会出现供区出血、感染、疼痛、腮腺管损伤、移植物挛缩和麻木等并发症。从膀胱培养尿道上皮是另一种方法，但它是一种侵入性的过程，会造成额外的损伤。干细胞具有很强的分化能力，可以分化或转分化成所有相关的细胞表型，并可以通过旁分泌活动调节再生过程，因此，干细胞疗法是一种很有前途的自体组织缺乏的修复方法，并可以减少与移植相关的并发症[36]。HFSCs能够分化为尿道上皮样细胞[37]，缺点是在移植后的几年里会在尿道腔内生长毛发[38]。利用干细胞或组织工程自体管状尿道的工程化移植物(有或没有支架)已经进行了尝试。Raya-Rivera等[39]报道，在5名尿道缺陷的男孩中使用管状尿道，将膀胱组织的干细胞植入合成管状网，制成组织工程管状尿道,再将其移植到5名尿道缺陷男性患儿体内，在平均71个月的随访中，成功率达100%。因此，使用富含ESCs的CEAs被认为是修复功能性尿道的理想方法，它不仅提供不长毛发的上皮细胞，而且可以很容易地获取而不会产生二次损伤[40]。

4.4 ESCs用于角膜缘干细胞缺乏的修复 角膜缘干细胞或其生态位的破坏或功能障碍可导致角膜缘干细胞缺乏（limbal stem cells deficiency, LSCD）。LSCD综合征的特征是存在角膜上皮稳态失衡，随后出现溃疡、结膜组织持续炎症和慢性疼痛,最终会因角膜混浊导致视力丧失[41-42]。目前的治疗方法主要包括角膜缘干细胞的移植及角膜缘干细胞的培养和移植[43]。角膜上皮与皮肤有许多相似之处，如典型的分层上皮形态和干细胞标记物p63的表达。动物研究表明，皮肤ESCs可以部分甚至完全恢复角膜透明度，重建的角膜上皮表达特异性标志物KRT3、KRT12[38]。HFSCs在模拟角膜缘微环境条件下培养，可以成功地在体外重新编程为角膜上皮细胞，但相关临床研究有限[43]。

4.5 ESCs用于白癜风的治疗 白癜风是一种慢性自身免疫性皮肤脱色疾病，在全世界患病率约为0.5%～2.0%[44]，其特点是黑色素细胞流失，导致皮肤出现典型的非鳞状白斑。目前白癜风的治疗方法有限，主要有308 nm单色准分子灯或激光靶向光疗、富血小板血浆及JAK抑制剂（如ruxolitinib乳膏）等治疗[45]。皮肤移植是一种常见的治疗方法，但经常导致皮肤表面不平整，且改善色素沉着的效果并不理想。CEAs联合或不联合黑色素细胞治疗白癜风已应用于临床。研究发现，当CEAs与一定数量的黑色素细胞共同移植后，与现有皮肤融合良好，颜色匹配良好，创面愈合而不产生瘢痕。此外，在50%～90%的患者中，应用无黑色素细胞的CEAs，然后暴露在阳光下，可以实现病变部位的重新着色[46]。毛囊和表皮作为皮肤组织中产生色素的细胞来源，被认为是治疗白癜风的有利细胞来源。HFSCs被认为在白癜风患者病变皮肤的色素沉着中起重要作用[37]。

4.6 ESCs用于大疱性表皮松解症的治疗 大疱性表皮松解症（epidermolysis bullosa，EB）是一种由层黏连蛋白5或胶原蛋白7缺失等基因突变引起的严重皮肤病，特点是即使是轻微创伤也会反复出现皮肤起泡，由此产生的慢性皮肤伤口总是会发展成复发性感染和瘢痕，这极大地损害了患者的生活质量。EB只有对症治疗，没有治愈疗法，治疗旨在缓解症状和诱导更稳定的上皮再生，如针对遗传缺陷用转基因干细胞替代表皮。基因治疗方法包括从基因异常患者中提取ESCs，通过基因转移在体外纠正突变，然后将细胞移植回患者皮肤中[47]。从结膜炎性EB患者身上提取带有层黏连蛋白亚单位β3（LAMB3）基因的ESCs可成功完成表皮再生，经ESCs治疗后患者体内可检测到功能性层黏连蛋白-5，在移植区可检测到正常的贴壁表皮，这表明利用ESCs进行基因治疗是一种有前景的遗传病治疗策略。

4.7 ESCs在抗衰老中的应用 老年人的皮肤常伴有表皮层和真皮层不同程度的萎缩变薄[48]，伴随着衰老，干细胞数量也不断减少[49]。ESCs具有多向分化的能力，可通过调控皮肤的再生、维持其稳态以及影响各种体液因子的活性来调控衰老的过程。衰老与干细胞的数量下降导致组织修复功能衰退有关[50]。体内研究表明，来自干细胞的外泌体不仅可以加速创面愈合和血管生成，而且对皮肤年轻化至关重要[51]。ESCs可调控增加成纤维细胞的Ⅰ型胶原蛋白生成，在皮肤保湿、维持真皮致密度、减少皱纹形成、减轻皮肤松弛下垂等方面发挥作用。该领域的进一步研究可能是现代皮肤病学和美容学的重大突破。

5 展 望

由于ESCs数量多、容易获得且在表皮形成和分化中具有多能性，在组织修复策略的研究中显示出良好的前景。目前ESCs在实验和临床应用方面还存在许多问题，如技术复杂、成本高，且多能性或胚胎干细胞产品的不规范使用已被证明会导致新生恶性肿瘤，鞘内注射联合干细胞会导致胶质神经增生病变等，但在未来，对ESCs的生物学知识和应用技术的安全性可能会提高，使ESCs在创面愈合和组织再生方面的应用更加广泛。