碳光子治疗仪局部照射对大鼠腓肠肌闭合性急性损伤的影响

刘文飞　谢光辉　佘文莉　刘宏伟

（暨南大学附属第一医院整形激光美容科，广东　广州　510010）

碳光子治疗仪局部照射对大鼠腓肠肌闭合性急性损伤的影响

刘文飞谢光辉佘文莉刘宏伟

（暨南大学附属第一医院整形激光美容科，广东广州510010）

目的：观察碳光子治疗仪局部照射对大鼠腓肠肌闭合性损伤后急性炎症反应、肌细胞损伤及肌肉再生情况的影响。方法：70只9周龄雄性SD大鼠随机分为3组：空白对照组（n=5）、损伤组（n=35）及损伤后照光组（n=30）。以500 g砝码从50 cm高度自由坠落击打大鼠腓肠肌，制备肌肉损伤模型。制模成功后损伤后照光组受损部位使用YW-0828A型碳光子治疗仪（波长320～5 000 nm，功率密度11.5 mW/cm2）每天光照20 min，连续10 d；损伤组及空白对照组同一部位接受相同机器的假性照射。在损伤后0（损伤后即刻）、1、2、3、5、7、14 d测量大鼠后肢损伤处的周径；取血进行中性粒细胞计数，磷酸肌酸底物法检测血清肌酸激酶，ELISA法检测血清C反应蛋白（CRP）水平；取肌肉组织进行组织病理学观察。结果：大鼠后肢在击打后即刻明显肿胀，伤后0、1、2、3、5、7 d较对照组后肢腓肠肌周径明显增加（P＜0.01）。损伤后照光组在损伤后第1、2、5、7天后肢腓肠肌周径较损伤组明显减小，损伤后照光组于伤后7、14 d，损伤组于伤后14 d达到空白对照组水平。损伤后照光组在损伤后1、3、5天中性粒细胞计数，损伤后1、2、3、5、7天的血清肌酸激酶含量及损伤后1、2、3、5天的血清CRP水平均明显减少（P＜0.01）。损伤组腓肠肌于损伤后即刻出现出血、水肿、变性及部分腓肠肌断裂，第7天可见新生的肌纤维，水肿减轻，第14天肌肉可见纤维化；损伤后照光组第7天镜下可见排列整齐的肌纤维和较少的成纤维细胞，第14天可见新生肌纤维排列整齐。结论：碳光子治疗仪照射可促进炎症吸收、减轻炎症反应，减少肌细胞损伤，促进骨骼肌的恢复。

碳光子治疗仪损伤腓肠肌炎症反应C反应蛋白肌酸激酶

临床所见的损伤中有30%与骨骼肌相关［1］，常见的骨骼肌损伤包括挫伤、撕裂伤、拉伤、缺血和完全断裂。骨骼肌损伤后大多有相似的组织修复过程，但不同的处理方式可导致不同程度的功能恢复［2］。传统急性闭合性软组织损伤处理的中心指导方法采用保护、休息、冷疗、加压包扎、抬高患肢原则（PRICE）。随着现代医学的发展，一些传统的处理方法开始受到挑战和质疑，有学者就明确提出 PRICE 应被更新为POLICE原则：保护（P）、最适负荷（OL）、冷疗（I）、加压包扎（C）、抬高患肢（E）［3］。体现了现代运动康复发展中的早期介入和个性化治疗的最新理念。近年来光线疗法在软组织损伤的治疗中应用越来越多［4］。在各种光线疗法中，碳光子治疗仪在皮肤创面［5］、慢性劳损［6］等的治疗中显示出良好效果。为进一步了解其对急性损伤性疾病的生理效应及治疗机制，我们采用自由落体打击伤造模器具制备大鼠骨骼肌急性损伤模型，观察碳光子治疗仪局部照射对大鼠腓肠肌闭合性损伤后急性炎症反应、肌细胞损伤及肌肉再生情况的影响。报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物与分组9周龄雄性SD大鼠70只，购自广州南方医科大学动物实验中心，体重320～350 g。动物在适宜环境下单笼饲养，自由进食，采用完全随机分组法分为3组：空白对照组（n=5）、损伤组（n=35）及损伤后照光组（n=30）。按取材时间，损伤组分为损伤即刻组（0 d）及损伤后1、2、3、5、7、14 d组，损伤后照光组分为损伤后1、2、3、5、7、14 d组，每组5只大鼠。

1.2骨骼肌损伤模型制备与处理参照文献［7］的方法建立骨骼肌损伤动物模型。两损伤组大鼠以10%水合氯醛 （330～350 mg/kg） 麻醉，将左后肢外展外翻、踝关节屈曲固定于装置上， 500 g砝码从50 cm高度自由落下，击打在左侧后肢跟骨上3 cm的腓肠肌上，撞击面积为0.785 cm2，冲量2.45 J。空白对照组同样方法麻醉但不予击打。

1.3碳光子治疗仪照射损伤后照光组在造模成功后2 h，使用碳光子治疗仪（YW-0828A型，广东伊万生物医药科技有限公司、江苏中哲碳光子研发中心有限公司） 局部照射，红色碳棒激发后发射碳光子波长为320～5 000 nm其中波峰范围在560～740 nm，功率密度为11.5 mW/cm2。碳光子治疗仪发射窗的中心位置垂直照射肌肉损伤部位，距离20 cm，光照每天1次，每次20 min，连续照射10 d。空白对照组及损伤组接受同一仪器、同样方法的无光假性照射。动物于相应观察时间点以水合氯醛麻醉后，进行相应指标的检测。

1.4观察指标

1.4.1后肢周径测量大鼠麻醉后肌肉处于松弛状态，外展伸直伤肢，在跟骨上30 mm击打处，用软尺测量腓肠肌周径，以反映其水肿程度。两损伤组大鼠在每次照光及取材前均测量后肢周径，空白对照组大鼠在每次假性照光前测量。

1.4.2血中性粒细胞、血清肌酸激酶和C反应蛋白（CRP）水平测定采集腹主动脉血2 ml，其中0.5 ml注入抗凝离心管中并迅速摇匀，6 h内使用全自动血球计数仪（Mek-7222k型，日本光电株式会社）检测中性粒细胞；另1.5 ml注入离心管中，自然凝血20 min，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清液，全自动生化仪（Hitachi 7600）检测肌酸激酶（试剂盒购自北京 Leadman公司），酶标仪（BioTek instruments BOX 998 ）检测血清CRP（大鼠CRP ELISA试剂盒购自武汉华美公司）。

1.4.3组织病理学观察分离两损伤组受伤部位及空白对照组相应部位的腓肠肌，立即置于4%多聚甲醛中浸泡24 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，4 µm切片，HE染色，光学显微镜下观察。

1.5统计学处理使用SPSS13.0软件对实验数据进行分析。多样本均数间比较用单因素方差分析及组间两两比较q检验，P＜0.05为差异具有显著性。

2　结　果

2.1大鼠后肢周径的变化大鼠腓肠肌受到击打后即刻组可见明显的局部肿胀，并可见表面淤血，较空白对照组大鼠的后肢周径明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。损伤组大鼠受到击打后腓肠肌肿胀迅速加重，损伤后第2天达到最高峰，随后水肿及表面淤血情况缓慢减轻，损伤后第14天完全消退。损伤后照光组于损伤后第2天后肢水肿最严重，但后肢周径较同时刻损伤组小（P＜0.01），随后水肿逐步减轻，在损伤后第7天完全消退。损伤后照光组在损伤后第1、2、5、7天腓肠肌周径均明显小于损伤组（P＜0.05或P＜0.01，见图1）。

图 1　伤后不同时间各组大鼠后肢周径的变化

2.2组织病理学观察空白对照组中肌纤维束呈现明显的交叉条纹及规律排列，无变性、坏死及炎性浸润或纤维化；损伤组大鼠腓肠肌则部分显示出变性、炎症、再生和纤维化。

损伤组损伤后即刻，受伤的腓肠肌有出血、水肿、变性及部分腓肠肌断裂。损伤后第1天受伤的腓肠肌可见组织间水肿、出血和炎症细胞浸润；损伤后第2天水肿加重，炎症细胞向周围正常组织间隙浸润；伤后第3天可见损伤肌肉及周围炎症细胞及组织间水肿最明显，已无出血现象；伤后第5天仍可见组织间水肿，炎症细胞继续扩散但总体炎症细胞减少；第7天可见一些结构紊乱的新生肌纤维，损伤区可见结构紊乱的纤维增生，水肿减轻；第14天受伤肌肉可见一些纤维化，但结构紊乱，组织尚未完全修复，受伤区有淋巴细胞聚集。

损伤后照光组在伤后第1天可见较集中的坏死和炎症细胞浸润，组织间明显水肿；第2天可见炎症细胞增加且较损伤组集中，炎症细胞聚集于损伤区，较少向周围正常组织浸润，可见组织间水肿消退迹象；第3天损伤区炎症细胞减少，可见在肌纤维断裂处出现纤维愈合迹象；伤后第5天可见纤维间水肿几乎消退，炎症细胞明显减少，已有肌纤维的再生及纤维愈合；第7天显示更多的排列整齐的新生肌纤维和相对少的成纤维细胞；第14天受伤肌肉基本愈合，可见新生肌纤维排列整齐，胶原纤维较少。损伤后照光组于伤后各时间点组织学异常较损伤组明显减轻，受伤后肌肉炎症浸润较轻且恢复明显加快。见图2（封二）。

2.3血中性粒细胞计数损伤组大鼠损伤后即刻可见中性粒细胞明显增加，伤后第1天达到高峰，随后开始下降，于伤后第7天恢复至正常水平。损伤后照光组中性粒细胞值同样在击打后即刻开始增加，至伤后第2天达到最大值，随后开始降低并在伤后第5天恢复至正常水平。损伤后照光组在损伤后第1、3、5天中性粒细胞计数明显低于损伤组（P＜0.05 或P＜0.01，见图3），且较损伤组更迅速地恢复到正常水平。

图 3　伤后不同时间各组大鼠血中性粒细胞水平的比较

2.4血清CRP的变化损伤后即刻损伤组大鼠CRP水平明显高于空白对照组（P＜0.01），并于伤后第1天达到最大值，随后缓慢下降，至伤后第7天，与空白对照组比较，差异无显著性（P＞0.05）。损伤后照光组同样在损伤后第1天达到最大值，随后缓慢下降，在伤后第5天与空白对照组相比差异无统计学意义。损伤后照光组在损伤后第1、2、3、5天CRP水平明显低于损伤组，并较损伤组更迅速地恢复到正常水平（见图4）。

图 4　伤后不同时间各组大鼠CRP水平的比较

图 5　伤后不同时间各组大鼠肌酸激酶水平的比较

2.5血清肌酸激酶的变化损伤组血清肌酸激酶水平在损伤后即刻便明显高于空白对照组，于第2天达到峰值，随后缓慢下降，第14天与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。损伤后照光组血清肌酸激酶同样在第2天达到最大值，随后缓慢下降，在伤后第7天即降至空白对照组水平。损伤后照光组在第1、2、3、5、7天肌酸激酶水平明显低于损伤组（P＜0.01），且较损伤组更迅速地恢复到正常水平（见图5）。

3　讨　论

光疗法是利用阳光或人工光线（红外线、紫外线、可见光、激光等）防治疾病和促进机体康复的方法，其生物效应的主要机制为光在生物组织穿透与吸收后能量的转换，组织通过不同的吸光色团吸收光子后将光能转化为各种光电活动导致组织生理学的变化。生物组织对光的吸收主要与光的波长相关，600 nm以下的光被浅表组织中的黑色素和血红蛋白强烈吸收，而红光及近红外光对组织有更强的穿透深度［8］，可深达肌层［9］。碳光子治疗仪使用以炭质材料制成的合成碳素棒，通过高温燃烧产生综合光，它是一种包含紫外线、可见光和红外光的宽谱光 （320～5 000 nm），称为碳光子或碳素光。紫外线（280～400 nm）在临床及实验中常用于杀菌消毒；蓝光（400～480 nm）可通过增加一氧化氮（NO）的释放而增加组织灌注、增强血管抗炎能力［10］； 可见光及红外光（400～1 000 nm） 局部照射后可通过光生物调节作用（PBM）达到减轻疼痛及炎症反应、免疫调节、促进创面愈合及组织再生的效果［11］。碳光子治疗仪的光源是一种高辉度的点光源，其发光中心点的绝对温度约为3 800 K（1 K=1 ℃+273.15）［12］。热辐射越强，光发出的光子数也越多［13］，生物组织接受的能量就更多。相比其他光源，碳光子具有宽光谱及高热辐射强度的特点，其光生物效应可深达皮肤、皮下组织和肌肉等深层组织［9］。

炎症反应是骨骼肌愈合的重要过程，但有研究证明炎症模型中的中性粒细胞可损伤肌细胞，要促进愈合必须限制炎症反应［14］。Smith 等［15］发现，运动后给予局部按摩可减少炎症期的中性粒细胞水平，从而减少运动性酸痛，并认为局部血管扩张导致的血流减慢可能是引起中性粒细胞浸润减少的原因。我们的研究显示，损伤后照光组在伤后第1、3、5天的中性粒细胞水平明显低于损伤组，损伤后第5、7、14天与空白对照组水平比较差异无显著性，而损伤组的中性粒细胞在损伤后第1天达到高峰，随后下降，至第7、14天才接近空白对照组水平，表明大鼠腓肠肌急性闭合性损伤后给予碳光子照射可明显减轻组织炎症期的炎性细胞浸润。

组织水肿是炎症反应水平的最直观反映［16］。本研究中损伤后照光组后肢周径在损伤后第1、2、5、7天明显较损伤组小，且在损伤后第7、14天与正常后肢周径无明显差异。而损伤组在损伤后第14天才达到空白对照组水平。表明碳光子照射可明显减轻大鼠腓肠肌急性闭合性损伤后的软组织肿胀，加速肿胀消退。

CRP是急性炎症时相蛋白，在人体感染后5～6 h开始上升，在36～50 h到达高峰。在动物肌肉劳损模型中可见，经过发光二极管光治疗（LEDT）后血清CRP水平明显降低［17］。Silhavy等［18］在小鼠炎症模型中抑制急性炎症反应后发现CRP水平明显降低。本研究中大鼠CRP水平于打击后呈现急性上升随后缓慢下降的变化趋势，于打击后第1天达到峰值，损伤后照光组在损伤后第1、2、3、5天CRP含量明显比损伤组更低，在伤后第5天降至空白对照组水平；而损伤组第7天才与空白对照组数值无明显差异。表明碳光子照射可明显减轻大鼠腓肠肌急性闭合性损伤后的炎症反应水平。

骨骼肌损伤后的修复过程已被证实包括以下5个阶段：变性、坏死、炎症、再生和纤维化（瘢痕形成）。急性损伤引起的炎症反应常可导致骨骼肌细胞的损伤增加，从而影响肌肉功能恢复。肌肉组织的机械性损伤破坏了肌纤维膜，同时激活蛋白酶，介导受伤肌纤维坏死，伤后组织迅速形成局部肿胀和血肿，可进一步促进肌肉变性、坏死。肌酸激酶是反映肌肉细胞损伤最常用的指标［19］。研究发现，人体骨骼肌损伤后第2天肌酸激酶水平迅速上升，于第5天达到高峰，随后下降，2周左右回到正常范围，且不同的运动损伤方式时肌酸激酶变化不完全一致［20］。本研究中，大鼠肌酸激酶水平于肌肉损伤后急性上升，第2天达到峰值，然后缓慢下降，照光后大鼠的肌酸激酶水平于伤后第1、2、3、5、7天较损伤组显著降低，第7天达到空白对照组水平，而损伤组肌酸激酶于伤后第14天达到空白对照组水平。提示碳光子照射后在炎症细胞降低的同时肌酸激酶水平也降低，与 Smith等［14］提出的炎症反应所引起的继发性肌细胞损伤理论相符，表明碳光子照射可明显减轻大鼠腓肠肌急性闭合性损伤后机械损伤或炎症反应引起的肌细胞损伤。

综上所述，在大鼠腓肠肌闭合性急性损伤后给予碳光子治疗仪局部照射可促进炎症吸收，减轻炎症反应，并减少继发性肌细胞损伤，促进骨骼肌的恢复。碳光子照射治疗有可能作为治疗急性肌肉损伤性疾病的辅助方法。

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Effects of local irradiation with carbon photon therapeutic apparatus on acute gastrocnemius muscle injury in rats

Liu Wenfei， Xie Guanghui， She Wenli， Liu Hongwei.
Department of Plastic， Laser and Cosmetic Surgery， the First Affiliated Hospital of Ji'nan University， Guangzhou 510010， Guangdong， China Corresponding author:Xie Guanghui （E-mail: xgh1398@163.com）

Objective: To observe the effects of carbon photon instrument therapy on acute inflammatory response，muscle cell damage and muscle regeneration following contusion of gastrocnemius muscle in rats. Methods: Seventy male SD rats aged 9 weeks old were randomly divided into 3 groups: control group （n=5）， contusion group （n=35）， and postcontusion irradiation （PCI） group （n=30）. The gastrocnemius damage model was prepared by free fall of 500 g weight from the 50 cm height. In PCI group， irradiation with YW-0828A type carbon photon instrument （wavelength 320-5 000 nm，power density 11.5 mW/cm2） was administered to the contused gastrocnemius muscle for 10 days with 20 minutes each day. The same parts of rats received sham irradiation with the same instrument in the contusion group and control group. Muscleinjury model was evaluated on 0 （immediately）， 1， 2， 3， 5， 7， 14 days after injury by measuring the circumference at the injury site of the hind limb of rat. At the same time， blood was sampled， and neutrophils were counted， the levels of creatine kinase and C reactive protein （CRP） were determined by phosphocreatine substrate method and ELISA respectively， and the pathological changes in the gastrocnemius muscle were observed. Results: The hind limbs of the rats were obviously swollen immediately after injury. Circumference of hind limb in contusion group was significantly larger than that of the control group on 0，1，2，3，5，7 days after injury （P＜0.01）. Irradiation significantly decreased the circumference of the hind limb， the difference was significant between the PCI group and contusion group at 1，2，5，7 days after contusion. The circumference of the hind limb was similar to that of the control group at 7 and 14 days in the PCI group or at 14 days in the contusion group. After irradiation， the neutrophils counts on 1，3，5 days， the levels of creatine kinase on 1，2，3，5，7 days and CRP on 1，2，3，5 days after injury was significantly reduced compared to the contusion group. After injury， the gastrocnemius in the contrusion

Carbon photon instrument；Damage；Gastrocnemius muscle；Infl ammation；C reactive protein；Creatine kinase

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 02. 004

广东省广州市花都区科技计划项目 （HD14CXY001）； 暨南大学第一临床医学院护理科研专项基金立项项目（2014305）

谢光辉，副教授（E-mail: xgh1398@163.com）group developed the hemorrhage， edema and degeneration of the gastrocnemius and fracture of a part of gastrocneminus immediately after the injury. newly formed muscle fibers and alleviated edema were seen on 7 days ， while muscle fibrosis was seen on the14th day. In PCI group， well-arranged muscle fibers and less fibroblasts were seen on the 7th day， and visible new muscle fibers arranged regularly on the 14th day. Conclusions: Irradiation with carbon photon instrument can promote the absorption of inflammation， reduce the inflammatory reaction， modify the damage to muscle cells， and promote the recovery of skeletal muscle.

2016-03-22）