浓缩生长因子的作用及其在组织修复领域应用的研究进展

王耀金 李永林

（1.新乡医学院第一附属医院，河南 新乡 453100；2.郑州市第一人民医院整形外科，河南 郑州 450000）

组织修复与创面愈合的过程复杂而有序，在修复的过程中有多种细胞生长因子的参与。生长因子是一类由细胞所分泌的、类似于激素的信号分子，在组织修复过程中，各种修复细胞所产生的生长因子能够调节机体的生长发育，也能调控淋巴细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞等修复细胞的表达、增殖分化和迁移。目前已发现生长因子可来源于多种不同组织，其靶细胞也各不相同。临床研究证实，单一的生长因子很难充分发挥生物学效应，浓缩生长因子（CGF）作为新一代血小板衍生物，无论在难愈性创面修复还是医学整形美容领域都能发挥重要作用，成为近年来研究的热点。现对CGF的作用及其在组织修复领域的应用进展综述如下。

1 CGF的来源

1.1 CGF的生理学背景 人体血液成分包括红细胞、血小板、白细胞以及其他有机成分。在血小板众多的活性物质和活性因子的研究中，细胞生长因子越来越成为研究的热点。生长因子及纤维蛋白原从活化血小板的α颗粒中释放出来，在止血、炎症反应以及组织再生重建方面发挥重要作用，其中生长因子参与细胞的增殖分化并促进细胞外基质的生物合成。人们对血小板的研究最初只是发现其具有凝血功能，之后经历了很长的时间才发现其分泌生长因子的功能。自体血小板浓缩物中富含内源性生长因子和纤维蛋白。纤维连接蛋白促进细胞与基质的连接，交联成网状支架后可形成纤维蛋白支架，这种支架结构中可储存机体组织修复过程中所需要的红细胞、炎性细胞及干细胞等，可作为临时基质保留和缓慢释放生长因子，避免“瀑布”效应，从而充分发挥这些成分的生物学效应[1]，降低由高浓度生长因子引起的组织水肿和炎症反应风险，促进组织修复与再生。

1.2 CGF的发展历程 根据不同的离心参数，迄今为止血小板浓缩物经历了3代，第1代是富血小板血浆（PRP），第2代是富血小板纤维蛋白（PRF），第3代是CGF。30年前第一代血小板浓缩物PRP开始应用于临床，其富含的血小板浓度是自体血液的4～7倍[2]，已在组织修复、创面愈合、骨科及医学美容等多个领域得到广泛应用，其安全性和临床效果得到证实。然而在PRP的制备离心过程中需要添加外源性激活剂（通常是氯化钙和凝血酶）激活，经过3次左右的梯度离心才制得，在一定程度上存在提取率低的问题；由于添加了外源性激活剂，还存在着机体过敏反应和感染的风险；在应用于机体的早期（24 h），高浓度的生长因子在浓度差的作用下释放明显，后期生长因子的释放速度较慢。组织修复是一个长期的过程，然而PRP无法在组织修复的整个过程持续发挥生物学效应，甚至有一些负向治疗效果的报道[3]。为了保证治疗效果，以血小板为基础的治疗方法应该有一个定义明确和标准化的方案。1999年Anitua[4]对这一方案进行了标准化：用钙或自体凝血酶代替牛凝血酶制备出了富含细胞生长因子血浆（PRGF）。然而有报道PRGF中所含白细胞比贫血小板血浆（PPP）少[5]。

PRF是第二代血小板浓缩制品，相比于PRP，其制备不需要添加使用外源性激活剂，使整个离心过程更加简化。PRF的纤维蛋白支架可以保护生长因子免受蛋白酶水解[6]，为细胞的黏附、迁移和增殖分化提供三维空间结构，一些聚集在纤维蛋白支架中的干细胞也可激发再生潜能，可维持生长因子的缓慢释放并在修复的过程中有效发挥生物学效应。由于制备PRF时不一致的离心力可能会导致血液浓缩物成分和效能的改变，且最初开发出来PRF无法在临床工作中进行注射操作，应用范围较窄。a-PRF是在低离心速度概念下发展而来[7]，具有松散的纤维蛋白网络，可刺激生长因子在10 d内持续释放。后期又研究出注射型PRF，并将其应用于牙槽骨种植及慢性难愈性创面愈合领域，进一步拓宽了PRF的临床应用范围，治疗效果良好。

1.3 CGF的制备 为了提高治疗效果，人们在PRP、PRF的基础上制备出第3代血液浓缩物，即CGF。其获取方法一般包括冷沉淀、过滤及离心，其中离心是一种简便、经济和重复性强的技术。2006年学者Sacco 开发出CGF，CGF最初被命名为PRF衍生物，其制备需要利用特制的变速离心机(Silfradent意大利），由于变速离心机本身的特点，交替改变离心速度与时间是离心机自动按照既定程序调节的[8]，一般来说，历时大约14 min的离心后，会建立3层血液成分：上层为贫血小板血浆，又称PPP；中间层含丰富的生长因子和纤维蛋白凝胶；下层为红细胞层。这种依靠物理性加速和减速切换的制备方式优于固定离心力的方式，交替的离心力使血小板与离心管发生碰撞的机会增加，进一步促进血小板裂解和生物活性分子发挥生物学效应。较前两代相比，CGF中含有更高浓度的CD34+，CD34+分子在造血干细胞移植过程中发挥运输作用，它能够参与炎症反应以及促进微循环系统的重建。由于CGF可在局部逐渐降解，临床一般采用冰融和冻干方法来减少其降解。CGF有着良好的促进组织修复与再生功能,已在骨科、牙槽骨种植、烧伤后瘢痕修复等领域得到应用。

2 CGF的生物学特性及功能

2.1 CGF的生物学特性 组织修复与再生的关键是干细胞、生物活性分子和支架结构，第1代血小板浓缩物PRP需要外源性激活剂（氯化钙及牛凝血酶混合）才能激活α颗粒释放生长因子，但使用外源性凝血酶可能会导致凝血因子Ⅴ和（或)Ⅵ抗体形成，进而影响机体正常凝血功能，甚至威胁生命。第2代血小板浓缩物PRF在制备时不一致的离心力可能会导致浓缩物成分和效能的改变。CGF作为第3代血小板浓缩制品，富含多种生物活性分子、抗炎介质和干细胞。其优点是：①CGF是自身来源的血液浓缩制品，不添加任何生物化学制剂，能有效避免外源性生长因子进入机体引起的免疫排斥反应及传播疾病风险；②CGF的制作流程更加简单，通过反复切换离心速度可释放更多的生长因子，CGF的结构类似于天然纤维蛋白，成为修复细胞的良好支架；③CGF含有较高浓度的白细胞，在抗感染、抑制细菌生长繁殖方面更具有优势；④CGF可制备成凝胶状态，为创面组织提供湿润环境，阻止细菌入侵，还能增加作用时间，促进创面愈合，CGF中还富含高浓度的CD34+细胞，在创面修复的过程中与炎性细胞协调发挥作用。

2.2 CGF的功能 CGF的功能主要体现在以下方面：①止血。 作为新一代血小板浓缩物，CGF在机体发挥着参与生理性止血和促进凝血的功能。②炎症的调节。纤维蛋白网状结构中除了有丰富的免疫细胞，还有如集落刺激因子、干扰素等免疫调节因子，这些细胞因子的存在使CGF能够发挥抗炎抑菌和免疫防御功能，能够促进创面修复和减轻创周炎症反应。③作为纤维蛋白支架。纤维蛋白作为一种基质，促进血液中血小板、白细胞以及小分子生物活性物质附着、增殖及分化，从而发挥生物学作用。CGF中含有纤维结合蛋白（fibronectin, FN)，FN分为细胞型和血浆型。FN影响细胞的黏附、迁移。CGF可作为一种支架结构维持生长因子的缓慢、持久释放，对人体创面修复过程有重要意义。④促进干细胞的迁移和增殖分化。CGF内有大量CD34+分子,这也是CGF和PRP的重要区别，CD34+分子的存在表明CGF中含有造血干细胞，能够促进组织修复与再生[9]。⑤调节细胞生长因子。在变速离心制备CGF的过程中血液与离心管壁的不断碰撞会充分激活血小板，并促进生长因子的释放，生长因子通过激活信号转导通路发挥生物学作用。

3 CGF的释放动力学

3.1 生长因子的作用 CGF作为第3代血小板浓缩物，含有众多生长因子。其中胰岛素样生长因子（IGF）被认为是中枢神经系统发育时期重要的自分泌和旁分泌信号分子，能够介导生长激素，调节组织生长发育，加速周围神经再生；转化生长因子（TGF）能够双向调节细胞的生长，对平滑肌细胞的促分裂作用较弱,但可增强成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的促分裂能力，表明不同生长因子之间存在一定的协同作用，临床中多采用联合应用多种生长因子的方式辅助修复创面。CGF作为生长因子的集合体，在促进血管增殖、改善局部微循环及创面愈合方面发挥着重要作用。

3.2 血小板浓缩物中生长因子的释放动力学对其生物活性模式的影响 有文献报道，PRP在应用1 h内完全释放生长因子，在组织再生和重建的早期阶段发挥作用，但这种释放动力学决定了其不能与长期复杂的再生过程相匹配[10]。有研究表明，PRF可持续释放生长因子7~10 d，而a-PRF可稳定释放14 d，随着纤维蛋白支架的降解，血小板团块逐渐降解，生长因子缓慢释放到局部微环境中[11]。CGF的释放动力学包括两个阶段[12]：第一阶段是大量活化的血小板和生长因子的单纯扩散；第二阶段由纤维蛋白支架的缓慢降解决定。CGF中每种类型的生长因子在应用早期都有其特定的释放动力学。研究发现CGF缓慢释放TGF-β超过13 d，并在第7天达到高峰。还有报道CGF可累计释放生长因子14 d后急剧下降。文献中释放动力学的差异可能是由于样本量和观察时间的不同而引起，但生长因子的持续释放可在再生重建的长期过程中发挥重要作用。Yu等[13]报道，CGF与纤维内矿化胶原结合可持续释放生长因子28 d，并出现两个浓度峰值日,将CGF与磷酸三钙结合也能得到相似的结果，这些组合构成了一个连续的给药系统，可适应长期的组织修复与再生过程。

4 CGF的临床应用

4.1 CGF在急慢性创面修复中的应用 创面修复的过程分为炎症反应（早期）、细胞增殖和（或）纤维结缔组织形成（中期）、创面重塑和收缩3个阶段（晚期）。在机体的调控下，不同的愈合阶段又相互联系、相互交叉。整个修复过程还包括各种炎症细胞、炎性介质、干细胞、生长因子及细胞因子成分。刘磊[14]认为在慢性难愈性创面愈合的过程中需要应用适宜浓度的生长因子，如果生长因子浓缩异常也会影响创面的修复时间和质量。王莹等[15]在创面修复的研究过程中发现，慢性创面（尤其是合并基础疾病的慢性难愈性创面，如糖尿病足）所分泌的生长因子无法满足正常创面修复的需求，针对原因，他们分析可能是成纤维细胞、巨噬细胞等修复细胞表达生长因子减少从而影响创面修复。付小兵等[16]在慢性难愈合创面的相关研究中显示出生长因子浓度比正常时升高的情况，高浓度的生长因子活性下降导致与靶细胞受体无法正常结合进而影响慢性创面的修复。CGF在创面愈合过程中发挥着重要作用，血小板被激活后可释放生长因子和细胞因子。在急、慢性损伤创面中，早期应用生长因子对于创面愈合具有很好的临床效果，不过在应用生长因子之前应采取必要的抗感染措施如去除创周坏死组织和彻底清创等[17]。处理慢性创面时也应注意病因治疗，如对于糖尿病慢性溃疡患者注意控制血糖和改善微循环[18]。有学者将CGF制备成凝胶状态，并应用于糖尿病足创面的治疗，结果发现与常规换药治疗组相比，CGF组能够缩短创面愈合时间。由于CGF中含有炎性细胞和修复细胞，在一定程度上能够减少瘢痕增生。刘坡等[19]探讨自体CGF治疗小腿部慢性难愈合创面的可行性和疗效，通过对研究中的56例患者行自体CGF纤维蛋白膜移植治疗，1~8周后创面完全愈合，研究证实应用CGF能够促进小腿慢性难愈合创面的愈合。有学者将CGF应用于开胸术后切口愈合不良伴局部骨髓炎患者，结果发现，应用CGF治疗有助于促进骨和软组织再生，缩短愈合时间，并有助于减少止痛药物使用次数及感染发作次数[20]。郭蔚莹等[21]将CGF应用于糖尿病大鼠创面，结果发现CGF中的碱性成纤维细胞生长因子成分在糖尿病创面修复过程中发挥着重要作用。另有研究证实CGF膜可促进创面上皮再生，并提出CGF膜治疗慢性创面的可能机制[22]：①在制作CGF凝胶过程中，分离离心可使血小板释放生长因子和细胞因子，促进创面愈合；②CGF凝胶中的干细胞和单核细胞可移动到创面底部增殖分化为巨噬细胞，进一步促进创面愈合。CGF膜的三维纤维蛋白网状结构及其所含生长因子可促进再上皮化和创面愈合。有学者提出CGF膜不仅是一层屏障，也是生长因子的来源及上皮细胞附着、迁移、增殖的基础[23]。

4.2 CGF在骨组织修复中的应用 基于不同类型生长因子的生物学特性，有学者利用骨髓基质细胞提供关键的种子细胞，将骨髓基质细胞与CGF结合形成纤维蛋白生物支架[24]，结果表明，CGF能够促进骨髓基质细胞增殖分化，对骨形成具有强大的促进作用，并具有辅助血管生成作用。罗婷苑等[25]选择24只新西兰兔，观察CGF联合珊瑚羟基磷灰石（CHA）在骨缺损组织修复方面的治疗效果，结果表明，CGF联合CHA能显著促进骨缺损创面的愈合。吴训等[26]在研究中建立了兔髁突全层软骨损伤模型，实验组通过用CGF填塞软骨缺损，而对照组仅用生理盐水冲洗，通过测定修复组织中软骨成分判定CGF应用于骨组织的修复效果，结果表明，CGF能够促进软骨组织修复。在一项对12例上颌前牙无牙患者的回顾性分析研究中，实验组种植体在种植前采用CGF膜覆盖种植腔，对照组常规种植，最终显示，CGF可促进种植体的稳定性[27]。有文献报道CGF能够促进齿源性间充质干细胞的增殖和成骨分化[28]，表明在牙髓再生治疗中，CGF是一种很有前途的生物材料。

4.3 CGF在抗衰老中的应用 面部衰老是由成纤维细胞增生不良和细胞外基质排列改变所致[29]。真皮层中I型胶原占80%。I型胶原在真皮层中交织成网，构成皮肤充盈饱满的基础。生长因子能有效促进I型胶原的产生，在面部年轻化方面具有良好的作用[30]。常见面部年轻化的治疗方法包括注射透明质酸和脂肪移植。透明质酸费用较高，且只在6~12个月内有效。单纯性脂肪移植可能引起局部肿胀。应用生长因子可能是一种新的有效治疗方法。CGF促进内皮细胞和成纤维细胞增殖并提高代谢活性，增加成纤维细胞的抗衰老活性，注射CGF能改善眶周皱纹，增加真皮-表皮交界处的厚度[31]。在自体脂肪填充方面，联合应用CGF可增加移植脂肪细胞存活率，减少细胞液化坏死。CGF作为组织修复与再生的重要介质，在治疗雄激素源性脱发（AGA）领域也有良好的应用前景[32]，可增加头发密度，优化AGA患者的无毛发外观。有学者观察了CGF联合肉毒毒素治疗AGA的临床效果，CGF能够促进AGA患者毛发再生。

5 总结与展望

综上，自体血小板浓缩制品经历了PRP、PRF和CGF 3个阶段。在血小板浓缩制品的提取、制备和临床应用效果方面，CGF有着稳定的生物学性能。在口腔科领域，CGF可辅助修复牙槽骨种植后的骨缺损及促进牙周组织再生；在医疗美容领域，CGF可联合脂肪颗粒辅助修复凹陷性瘢痕并减少脂肪液化坏死；以血小板为基础的自体治疗开拓了再生医学新领域。应用生长因子促进创面愈合的原理相对清楚,生长因子作用于不同类型创面的效果以及在创面修复不同阶段的特点尚不明确，不同浓度的CGF与创面修复之间是否存在量效关系、不同类型的生长因子在不同创面中的疗效也缺乏较为全面的比较，不同类型的生长因子协同发挥作用的方式尚不明确。CGF被证实含有高浓度的生长因子，由于活化血小板α颗粒和mRNA水平不同，每种生长因子都有其独特的释放动力学，对于不同生长因子的释放动力学尚需进一步研究。使用比正常血液中浓度高的生长因子是否能够引起细胞癌变值得高度重视,有待进一步的研究。