多种遗传学检测技术在脐血穿刺中的临床应用研究

袁慧珍，刘艳秋，周萍，王欣荣，黄淑晖

（江西省妇幼保健院医学遗传中心 江西省出生缺陷防控重点实验室 江西省医学领先学科建设计划项目，南昌 330006）

据统计全世界每年有500多万出生缺陷，我国每年出生缺陷儿100多万，占出生人口的5%。其中遗传因素占25%，环境因素约占10%；遗传和环境综合或病因未知占65%[1]。如果染色体发生数目或结构的异常，将会引起许多基因的缺失或重复，因而染色体病常表现为多种异常或畸形的综合征[2]。近年随着产前分子诊断遗传学技术的发展，荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）技术、荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction，QFPCR）技术、染色体微阵列技术（Chromosomal Microarray Analysis，CMA）、低深度全基因组拷贝数变 异测序 (Copy Number Variation Sequencing，CNV-seq)等已逐渐成熟及广泛应用于临床，其中QF-PCR可以根据短串联重复序列(Short Trandem repeat，STR)等位基因的个性化信息判别多余染色体的来源，鉴别母体细胞污染（Maternal Cell Contamination，MCC），也可快速诊断出目标染色体的非整倍体数目异常[3]；CMA缓解了传统核型分析的压力，同时在深度上更详细地对染色体数目和结构进行分析，并能综合染色体微缺失微重复的片段位置、大小、来源及数据库和相关文献对其致病性进行评估[4]。妊娠中晚期抽取脐血进行染色体分析是产前诊断的主要方法之一，本文对576例胎儿脐血染色体检查的结果进行了回顾性分析，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2019年1月至2021年4月在江西省妇幼保健院产前诊断中心行脐血穿刺的孕妇576例，均进行染色体核型分析、QF-PCR及CMA检测，孕周≥24周，年龄18~39岁；若无创DNA提示胎儿性染色体异常，同时进行FISH检测。脐血穿刺指征：超声提示胎儿发育异常、夫妇之一为染色体异常携带者、母血中胎儿游离DNA检测（non-invasive prenatal test，NIPT）阳性、不良生育史等。所有孕妇均签署知情同意书。

1.2 方法 在超声引导下抽取2~4 mL脐血标本进行染色体核型分析、QF-PCR及CMA检测；若无创DNA检测结果提示性染色体异常，同时进行FISH检测。查询国际数据库包括DECIPHER、Database of Genomic Variants (DGV)、Online Mendelian Inherit-ance in Man(OMIM)、UCSC Genome Browser、ENS EMBL等进行致病性分析，依据ACMG（American College of Medical Genetics and Genomics）判读指南进行CNVs致病性的判读。

2 结果

2.1 染色体核型与FISH结果 在576例脐血穿刺中，经染色体核型分析共发现染色体核型异常78例和染色体多态性变异42例，胎儿染色体核型异常检出率13.54%（78/576），其中染色体数目异常占78.20%（61/78），染色体结构异常占21.80%（17/78）；常染色体异常占66.67%（52/78），三体综合征占65.38%（51/78），其中最多的是21-三体综合征，占51.28%（40/78）；性染色体异常占20.51%（16/78）。FISH结果与染色体核型结果一致。见表1。

2.2 染色体微阵列分析结果 与核型分析结果不一致且具有临床意义的拷贝数变异21例，额外增加了3.65%（21/576）的异常检出率。见表2。

表1 染色体异常核型及多态性变异核型

1例脐带血存在一定比例的母源污染，通知孕妇重新取样检测，重新取样后的检测结果与染色体核型结果一致；其他均无母体细胞污染。无法判断是否存在18号染色体数目异常2例，其余与染色体核型结果一致。

3 讨论

染色体是遗传物质的载体，由DNA和蛋白质等构成，具有储存和传递遗传信息的作用。如果染色体发生数目或结构的异常，将会引起许多基因的缺失或重复，因而染色体病常表现为多种异常或畸形的综合征，又称为染色体综合征[2]。

本研究中，在576例脐血穿刺中，检出染色体核型异常78例和染色体微缺失微重复综合征21例，胎儿染色体异常的检出率为17.19%（99/576），其中胎儿染色体核型异常检出率13.54%（78/576），染色体微阵列分析提高了3.65%（21/576）的异常检出率。胎儿染色体异常的检出率略高于周俊[5]等的研究结果。本文研究对象主要为超声提示胎儿结构异常和NIPT阳性的孕妇，有研究表明：超声结构异常的染色体异常检出率高于超声非结构异常的检出率；当超声结构异常出现两项及以上时，染色体异常发生率会明显增高[6]。NIPT用于检测胎儿常见的非整倍体及部分性染色体异常，敏感度：21-三体为0.994(0.983-0.998)，18-三体为0.977(0.952-0.989)，13-三体为0.906(0.823-0.958)；特异性均达到0.999以上[7]。本研究中染色体微阵列分析提高了3.65%（21/576）的阳性检出率。与相关研究结果相符，CMA的阳性检出率仍然较低（并非所有病例都能发现具有临床意义的CNV），对于超声检查发现结构异常但胎儿染色体核型正常的病例，目前CMA增加检出致病性CNV的比例<10%[8]。

小额外标记染色体 （Small Supernumerary Markerchromosome，sSMC）是指在染色体核型分析中，除正常染色体外，出现的不明结构、无法辨别其来源和特征的染色体，导致染色体数量和基因拷贝数发生变化，其可来源于任何一条染色体，携带者临床症状从无到严重畸形［9］。本研究中，1例核型为47，XN，+mar[18]/46，XN[32]的新发标记染色体，CMA结果显示arr[GRCh37]1p21.1q23.1(105438124_157720286)×3，为致病性变异。孕妇及家属知情后选择终止妊娠。

QF-PCR技术是一种利用荧光引物对染色体上特异的短串联重复序列（Shrot Tandem Repeat，STR)位点进行扩增，通过荧光检测对染色体数目异常做出快速产前诊断的方法[10]。同时可以排除胎儿产前诊断样本中的母体细胞污染。本研究中有1例脐带血存在一定比例的母源污染，通知孕妇重新取样检测，重新取样后的检测结果与染色体核型结果一致；其他均无母体细胞污染。无法判断是否存在18号染色体数目异常2例，其余与染色体核型结果一致。

对于怀疑嵌合的患者，取羊水或脐血等直接进行FISH检测，不受细胞培养过程中选择性生长的影响，可以更真实地反映胎儿体内的细胞嵌合状况，对于判断胎儿预后会有更多帮助[11]。目前英国临床细胞遗传协会已把采用间期细胞的FISH技术作为产前嵌合体检查的筛查方法[12]。本研究中对无创DNA提示胎儿性染色体异常时，进行FISH检测，以提高性染色体嵌合体的检出率。

综上所述，脐血穿刺作为孕中晚期产前诊断的主要手段，必须选择细胞生物学或者分子生物学分析方法，明确产前诊断标本的来源，以免发生母体细胞污染。染色体核型分析与CMA相结合可以提高胎儿异常的检出率，必要时应用FISH进行综合分析，从而更加准确地确定染色体异常类型以及异常核型的嵌合比例，为孕妇及其家属提供精准的遗传学咨询及建议，有效防止缺陷患儿的出生。