NAFLD 合并II 型糖尿病患者肠道菌群分析研究

田楠楠

（河南省焦作卫生医药学校附属医院检验科，焦作 450001）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种发病率最高的慢性肝病之一，指除了酒精和其他确切致肝损伤因素外，以肝细胞脂肪过度沉积为主要表现的全身代谢综合征[1]。糖尿病由一系列危险因素（如遗传、超重、年龄及不良生活习惯等）引起的疾病，其中85%～95%为II 型糖尿病（T2DM）[2]。NAFLD 与T2DM 关系密切，常伴随脂代谢紊乱和动脉粥样硬化等疾病，T2DM 患者中NAFLD 的患病率为50%～80%，而NAFLD 患者中糖尿病的发病风险升高2～5 倍，NAFLD 合并T2DM 者的严重肝病事件发生率会明显上升[3-4]。肠道菌群种类可达1000 多种，细菌总数有100 万亿，肠道微生态系统是人体最大最复杂的微生态系统，对维持机体稳态有重要作用。肠道与肝脏来源于同一胚层，二者在结构和功能上有关系密切，因此肠道微生态的失衡与NAFLD 也有密切关系。肠道菌群紊乱会打破宿主能量吸收和储存的平衡，能量吸收速率增强，常伴随体重的显著增加，进一步加重代谢紊乱程度，同时能加重胰岛素抵抗和肝脏内的炎症反应，使肝脏毒素的产生增多，最终导致肝纤维化、肝硬化甚至发生肝癌[5]。本研究通过研究NAFLD 合并T2DM 患者和健康人群的肠道菌群情况，以期为该病的治疗提供一定的思路，具体如下。

1 研究对象

1.1 基本信息 以2017 年1 月至2019 年12 月就诊于我院的NAFLD 合并T2DM 患者为研究组，共86 例，其中男性50 例，女性36 例，平均年龄（41.6±15.3）岁；另以80 例健康人群为对照组，男性50例，女性36 例，平均年龄（42.7±14.8）岁。两组基本信息如性别构成比、年龄等经分析无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。患者及家属均充分了解研究内容并签署知情同意书，本研究已获得医院伦理委员会的准许。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：（1）符合NAFLD和II 型糖尿病的诊断标准[6-7]；（2）年龄18～75 岁者；（3）BMI≥18.5；（4）无其它系统重大疾病。排除标准：（1）合并酒精性肝病、慢性乙肝、慢性丙肝等肝病者；（2）近期服用过抗生素、微生态制剂以及胃肠动力药者；（3）有炎症性肠病、库欣综合征、甲状腺功能减退症等患者；（4）已进展至肝硬化阶段者。

2 研究方法

2.1 标本采集 所有研究对象于入院24 h 内，采集粪便样品，使用粪便采集管收集3～5 g 标本，存于-80 ℃冰箱。

2.2 检测方法 采用QIAamp ®DNA Stool Mini 试剂盒进行肠道菌群的监测，严格按说明书进行操作。将样本与ASL 液混合均匀，进行细菌裂解、孵育离心后清除粪便抑制剂，以醇沉法提取DNA 以去除多糖、蛋白质。以缓冲液溶解后过柱子进行极性洗脱，回收洗脱液得粪便细菌总DNA，以illumina hiseq 平台检测肠道菌群情况，对样本基因片段进行测序，读取核苷酸种类，通过每轮所收集的荧光信号获得模板DNA 片段的序列。

2.3 观察指标 采用Usearch 10.0 在97%相似度下进行聚类获得操作分类单元（Operationa l taxonomic units，OTU），根据Silva 数据库对OTU 进行分类学注释，采用Qiime 1.9.0 进行alpha 多样性分析，以了解样本微生物多样性程度，利用Kruskal?Wallis 计算丰度差异情况等。

2.4 数据处理 以SPSS 19.0 对数据进行分析，计量资料以()表示，使用t 检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果分析

3.1 两组OTU 分布比较 在97%相似度的水平下，本研究对研究组和对照组的样本测序数据进行OTU 聚类，比较两组中共有和独有的OTU 数，结果见图1 所示。两组共得到OTU 数为713 个，其中有480 个为研究组和对照组所共有的，研究组独有OTU 数为81 个，对照组独有OTU 数为152个，对照组OTU 多于研究组。

3.2 样品Alpha 多样性 研究组Shannon、Simpsin、ACE、Chaol 指数与对照组相比无显著差异（P＞0.05），Observe 指数显著低于对照组（P＜0.05）。表明研究组肠道菌群丰富度低于对照组。

表1 两组a 多样性指数比较

3.3 两组肠道菌群丰度差异 在门水平上，与对照组相比，研究组厚壁菌门、放线菌门和柔壁菌门丰度降低，抑杆菌门丰度显著升高，差异有有统计学意义（P＜0.05）。在属水平上，研究组Subdoligranulum、Enterobacter、Coprococcus、Klebsiella、Bifidobacterium、Lactobacillus 属菌显著减少，而Bacteroides、Flavonifractor 菌属显著增加（P＜0.05）。

3.4 LEfSe 分析根据 根据微生物分类数据，进行LEfSe 分析，显示研究组中以拟杆菌、产碱菌、幽门螺杆菌等致病菌为优势菌；对照组中以厚壁菌门、双歧杆菌以及乳酸杆菌等有益菌为优势菌。

4 讨论与结论

NAFLD 是指没有饮酒嗜好的人肝内脂肪蓄积甚至发生脂肪变性和炎性改变，患病率呈逐年升高趋势，其发病机制主要是由游离脂肪酸增多所导致的胰岛素抵抗和氧化应激，常合并糖尿病，肥胖、高血脂、高血压等疾病，有研究表明：NAFLD 可能为一种胰岛素抵抗在肝脏的表现[8-9]。T2DM 与NAFLD 紧密联系，互相影响。肠道菌群的紊乱可能与NAFLD 的进展有关。肠道菌群的改变能通过促进胰岛素抵抗、生成内源性乙醇、产生内毒素引起体内的炎症反应等途径，推动NAFLD 及其代谢综合征的进展[10]。各种原因引起的肠道菌群的细菌移位，能产生LPS、肽聚糖等代谢产物，刺激炎症因子的释放，激活多种炎症通路，进而引起脂质胆碱代谢、内源性乙醇的生成等一系列病理变化，使IR和脂质产生病理性累积，最终导致NAFLD 及T2DM 等代谢综合症[11]。

表2 两组在门、属水平上肠道菌群丰度差异比较

在97%相似度的水平下，本研究对研究组和对照组的样本测序数据进行OTU 聚类，结果显示两组共得到OTU 数为713 个，其中有480 个为研究组和对照组所共有的，研究组独有OTU 数为81个，对照组独有OTU 数为152 个，对照组OTU 多于研究组。表现为NAFLD 合并T2DM 患者的肠道菌群多样性总体上较健康人群低。对三组α 多样性指数进行分析，显示Observe 指数显著低于对照组，表明研究组肠道菌群丰富度低于对照组，而两组间Shannon、Simpsin、ACE、Chaol 指数无统计学差异。可能与研究中纳入的样本量较小有关。

肠道菌群与肝脏在功能上也有密切联系，与机体的营养、代谢和免疫等均有紧密相关，其中厚壁菌门和拟杆菌门是主要的细菌，占总微生物群落的99%左右[12]。在门水平上，与对照组相比，研究组厚壁菌门、放线菌门和柔壁菌门丰度降低，抑杆菌门丰度显著升高，差异有统计学意义。在属水平上，研究组Subdoligranulum、Enterobacter、Coprococcus、Klebsiella、Bifidobacterium、Lactobacillus 属菌显著减少，而Bacteroides、Flavonifractor 菌属显著增加（P＜0.05），显示Bacteroides、Flavonifractor 菌属可能为NAFLD 及T2DM 的危险因素。根据LEfSe 分析结果显示研究组中以拟杆菌、产碱菌、幽门螺杆菌等致病菌为优势菌；对照组中以厚壁菌门、双歧杆菌以及乳酸杆菌等有益菌为优势菌。拟杆菌科中的多形拟杆菌能分裂糖苷键，可降解无法被人体吸收的植物多糖，增加肠道10%～15%的能量吸收，进而增加宿主脂肪含量[13]。拟杆菌在死亡过程中会产生大量脂多糖（LPS），LPS 局部蓄积于肠道引起炎症，通过门静脉进入肝脏，被存在于肝巨噬细胞上Toll 样受体4（TLR4）识别后，活化LPS/TLR4 信号通路引发肝脏炎症和胰岛素抵抗，参与NAFLD 发病[14]。肠道幽门螺杆菌能引起转化生长因子-β1 的表达增加，并激活肝星状细胞促炎信号通路，促进细胞外基质的形成同时抑制其降解，进而诱导肝细胞凋亡等机制在肝炎进展中起促进作用[15]。

综上所述，NAFLD 合并T2DM 患者肠道菌群丰富度下降，与健康者有较大差异。