加味四君子汤对烫伤肠黏膜及炎症因子的影响

许志俊，罗锦花，詹剑华，程兴，黄凯

（南昌大学第一附属医院烧伤科，南昌 330006）

在机体遭受严重的打击后往往最先引发肠道的感染。 肠道感染可能导致败血症和MODS，在这些情况下，肠源性感染被认为是主要的死亡原因。肠道菌群与黏膜固有免疫力之间的相互作用会受到严重干扰。 先天性免疫失调，微生物群失调和细菌易位似乎会形成正反馈回路，共同导致严重疾病中不可控制的炎症反应和败血症等并发症[1]。 肠道黏膜免疫屏障在机体免疫系统至关重要。四君子加味汤可以明显加强肠道黏膜免疫，调节肠道菌群[2]。患者烧伤程度越深，面积越大，持续时间越久，引起血清炎性因子TNF-α 明显增加[3]。 四君子汤是我国中医经典的补益剂，常用于临床胃肠道疾病。人参、茯苓、白术和甘草组成传统的四君子汤，而本研究使用党参替代人参， 并增加黄芪和薏苡仁用来增强其对肠道黏膜的保护及抗炎作用。 加味四君子汤对肠道功能的保护， 可能是通过降低炎症因子来实现的。 因此本实验在30% TSBAIII 度烫伤兔模型上， 观察严重烫伤后肠道屏障功能及炎症标记物， 讨论不同浓度的加味四君子汤对其的影响，并找到最佳疗效浓度及所需时间。

1 材料与方法

1.1 加味四君子汤制备 中药：党参300 g、白术300 g、茯苓350 g、甘草150 g、黄芪300 g、薏仁200 g，药材来源于南昌大学第一附属医院。把中草药一起放入药锅中先用0.9% NaCl 5000 mL 浸泡30 min 后，再加入0.9% NaCl 5000 mL 煮沸后小火熬60 min，滤去残渣，可得药液320 mL,生药浓度为5.0 g/mL，4 ℃保存，用蒸馏水配比出不同浓度的药液分组实验。

1.2 动物分组、处理与制模

1.2.1 动物分组及处理 90 只兔， 重2.0 kg 左右，实验动物购自南昌龙平兔业有限公司，许可编码：SCXK(jiangxi)2014-0005。随机分5 组，每组18 只，A 组：自饮水。 B 组：伤后，给予0.9% NaCl 灌胃，10 mL/次，tid。C 组（0.2 g/mL）：伤后，给予0.2 g/mL加味四君子汤灌胃，10 mL/次，tid。 D 组（1.0 g/mL）：伤后， 给予1.0 g/mL 加味四君子汤灌胃，10 mL/次，tid。 E 组（5.0 g/mL）：伤后，给予5.0 g/mL 加味四君子汤灌胃，10 mL/次，tid。 在灌胃后第1、3、7 d各6 只用于取样和检测。

1.2.2 烫伤组制备 实验兔称重后， 用速眠新肌松后再以水合氯醛腹腔麻醉，电动剃须刀背部剃毛，禁食12 h。 第二天，以同样方法麻醉实验兔，热水（90～92℃）烫伤时间设置为20 s，造成30%TSBAIII度烫伤。 烫伤后给予每千克40 mL 的乳酸钠林格抗休克，用碘伏对创面进行常规消毒，防止创面感染影响实验观察。 取兔注入空气处死， 取回肠黏膜，用0.9% NaCl 漂洗后，放入甲醛中保存，贮存于4 ℃冰箱。

1.3 观察指标 观察各组兔烫伤后回肠黏膜组织病理学形态变化情况。 行ELISA 检测不同组烧伤后第1d、3d、7d 的回肠黏膜中炎症因子：TNF-α、IL-1β、IL-10。

1.4 统计学分析 应用SPSS 19.0 统计软件，用（x±s）表示。 三组及以上数据用χ2检验，两组比较用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组回肠黏膜病理学形态变化 烫伤前可见皮肤正常，伤后2 min 可见皮肤变红，伤后第1 d，可见水泡形成，皮肤弹性差，伤后第3 d、7 d，见皮肤焦黄，水分基本丢失，分界清晰，硬如皮革。 可见病理学形态改变： 镜下可见炎性细胞大量弥散在烫伤的组织附近，绒毛结构基本被破坏，组织明显肿胀及渗出。 A 组：回肠黏膜无明显改变；B 组：回肠黏膜可见炎性细胞大量弥散在烫伤的组织附近，绒毛坏死，组织肿胀及渗出明显。 给药组疗效与时间正相关，以D 组（1.0 g/mL）浓度给药7 d 疗效最好。 见图1。

图1 回肠黏膜病理学形态变化

2.2 加味四君子汤对回肠黏膜组织中炎症因子TNF-α 值的影响 在同一天， 与A 组比较，B 组中的TNF-α 值显著上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；与B 比较，第1 d D 组TNF-α 值显著降低；在第3 d、第7 d，低、中、高剂量3 个组中的TNF-α 值均明显下降，与C 组比较，在第1 d D 组TNF-α 值显著降低；在第3 d、第7 d 的时间点，D 组和E 组中的TNF-α 值表达都显著降低；与E 组比较，各时间点的D 组中的TNF-α 值都明显下降，有统计学意义（P＜0.05）。 见表1。 A 组中的第1 d、第3 d、第7 d 炎症因子TNF-α 值基本保持同等水平， 无统计学意义；在B 组，随着时间进展TNF-α 值逐步上升且在第7 d 达到最高；在D 组和E 组,7 d 内伴随用药时间延长TNF-α 值逐步降低, 第7 d 降到最低。

表1 加味四君子汤对回肠黏膜组织TNF-α 水平的影响

2.3 加味四君子汤对回肠黏膜组织中炎症因子IL-1β 值的影响 在同一天， 与A 组比较，B 组中的IL-1β 值显著上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；与B 组比较，第1 d D 组中的IL-1β 值显著降低；在第3 d、第7 d，低、中、高剂量组中的IL-1β 值均下降；与C 组比较，在第1 d D 组中的IL-1β 值显著降低，在第3 d、第7 d，D 组和E 组中的IL-1β值显著降低；与E 组比较，同一天中的IL-1β 值，D组都显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表2。 A 组中的第1 d、第3 d、第7 d 炎症因子IL-1β值基本保持同等水平， 差异无统计学意义； 在B组，IL-1β 值逐步上升，在第7 d 达到最高峰；在D组和E 组中随着时间进展IL-1β 值逐渐下降且在第7 d 达到最低。

表2 加味四君子汤对回肠黏膜组织IL-1β 水平的影响

2.4 加味四君子汤对回肠黏膜组织中炎症IL-10值的影响 在同一天， 与A 组比较，B 组的IL-10值显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与B 组比较，在第1 d，D 组中IL-10 值显著上升，在第3 d 和第7 d，C、D、E 三个组中的IL-10 值都明显升高；与C 组比较，第1d，D 组中IL-10 值显著上升，在第3 d、第7 d，D 组和E 组中的IL-10 值显著上升； 与E 组比较， 同一天，D 组中IL-10 值显著上升，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。A 组中的第1 d、第3 d、第7 d 炎症因子IL-10 值基本保持同等水平，差异无统计学意义；在B 组，IL-10 值逐步降低，第7 d 达到最低；在D 组和E 组IL-10 值逐步上升，第7 d 达到最峰值。

表3 加味四君子汤对回肠黏膜组织IL-10 水平的影响

3 讨论

在遭受到严重烧伤的情况下，机体处于应激状态，供血的重新分布，肠道黏膜缺血导致黏液层形成的黏膜屏障遭到破坏，炎性标记物会增加，肠道的免疫屏障功能同样遭到破坏[4]。 这两个屏障的相互作用维持了正常的肠道功能和稳定的肠道环境。 完整的肠道屏障不仅仅可减少各种病原体的入侵，对于内环境动态平衡也起到不可缺失的作用[5]。 严重的灼伤可能会导致肠道炎症因子释放和氧化应激， 从而导致肠道屏障损伤和肠道功能障碍。 在严重烧伤的治疗中，需要采取相应疗法来减轻全身炎症反应并控制氧化应激的负担[6]。 严重的烧伤可导致肠道炎症因子释放， 第一个损害的免疫器官大多是肠道免疫器官[7]。

四君子汤调控肠道菌群、扶植优势菌群、增强菌群多样性和抑制致病菌群繁殖[8-9]。 而本研究中的加味四君子汤以党参代替人参， 从中医理论的补虚症上党参可替换人参， 并且在免疫促进功能上党参多糖更具有独特优势[10]。之前课题研究表明黄芪多糖可改善肠道的黏膜和增强肠道的免疫细胞S-IGA 分泌[11]。 薏苡仁在中药理论中有着祛湿利水的作用，可以促进肠道菌群的调节，加快肠道细胞的更新代谢[12]。本课题之前在严重烫伤大鼠实验中发现，各种炎症因子上升，加味四君子汤（用药浓度1.0 g/mL）可以减少炎症因子释放，抑制炎症细胞附着肠黏膜上，从而对肠道的黏膜系统起到保护作用[13]。 当前，在中药监管当局的研究开发中， 关于单一中药和单体成分的研究在增加，关于复方药剂的研究却很少，且不够充分。 但是，充分发挥复方药剂中各种药物的协同效果正是中药的本质，在实际应用中还有很多优点。

肿瘤坏死因子-α 来自巨噬细胞，常随炎症反应而出现。 梁建国[14]等人发现TNF-α 在烧伤后平均第1～3 d 达到高峰，对烧伤患者病情评估、演变及预后具有一定治疗指导。 严重的烧伤会诱导凋亡细胞因子的大量分泌。 在这些因素中，TNF-α 和NF-κB 被认为是细胞凋亡调节的关键。 烧伤可引起 血 清 中 生 成 大 量 的IL-1β、IL-6、MCP-1 和CRP，烧伤后可引发生全身性炎症反应[15]。伤后IL-1β 可以与TNF-α 可以相互促进加重反应[16]。 IL-10 是人体不可缺失的抗炎因子之一, 对于其他的炎症因子的合成和释放有一定促进作用,其还可以抑制单核或巨噬细胞抗原表达、抑制TNF-α 受体的表达及释放、抑制免疫、 可维持促炎和抗炎因子的动态平稳[17-18]。

综上所述，检测到烫伤组中回肠黏膜的TNFα 和IL-1β 的表达水平升高，相反抗炎症因子IL-10 表达水平下降， 说明烫伤可能刺激肠道炎症反应，是严重烧伤早期肠屏障损害的机制之一。 由本实验可知， 加味四君子汤用药浓度为1.0 g/mL 时TNF-α 和IL-1β 值明显下降，IL-10 值明显升高，并且这种效果在持续7 d 后效果更佳。也证实加味四君子汤对烧伤后引起的肠道炎症反应有一定的调控作用， 为寻求改善肠道功能提供新思路，而其对严重烫伤兔肠黏膜的作用靶点及相关机制，仍需进一步研究。