参附注射液对幼鼠脓毒血症急性肝损伤的保护机制

金国强，洪燕，余伟，吴俭，刘赟

（1.南昌大学第一附属医院保健科；2.江西省儿童医院儿童保健科；3.南昌大学第一附属医院儿科，南昌 330006）

脓毒血症是人体对感染反应失调进而引发全身性炎症反应的综合征。 脓毒血症患者如果没有得到早诊断早治疗则会进展为严重脓毒血症、脓毒性休克甚至多器官功能不全[1]，进而危及患者生命。 多个脏器的损伤是脓毒血症的临床表现之一，研究证实急性肝损伤可发生在脓毒血症的早期、中期、晚期等各个阶段，发生急性肝损伤是脓毒血症预后不好的指标之一， 故此积极的诊治脓毒血症急性肝损伤意义非凡[2]。 参附注射液（Shenfu Injection，SFI）为传统中药，在急救患者的临床应用中效果尚可，由于其作用机制目前研究不多，推广应用不多。 本研究通过腹腔注射脂多糖构建幼鼠脓毒血症模型， 研究参附注射液对脓毒血症引发的急性肝损伤的保护机制。 现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料 48 只S PF 级幼鼠（4 周龄），雌鼠与雄鼠各占50%，重量范围为120 g～150 g，由南昌大学江西医学院（医学部）的动物实验中心供给，许可证号SYXK-（赣）2010-0002。

1.2 药物与试剂 脂多糖(LPS， from Escherichia coli 0111:B4, L2603-10 mg)，生产公司：美国Sigma公司。 参附注射液（SFI，Z51020664），生产公司：雅安三九。 兔抗鼠TNF-α 多克隆抗体（BS1857），生产公司：Bioworld。乙酰胆碱试剂盒（Ach，A105-1）,乙酰胆碱转移酶试剂盒(ChAT，A079-1）, 生产公司：南京建成生物工程研究所。

1.3 建立模型及分组 全部幼鼠根据体重由小到大排号，根据随机数字表法分为3 组：空白对照组（Ctrl）、脓毒血症组（LPS）、治疗组（SFI）。 各组16只。 进而各组均分成6 h、12 h 亚组，各亚组8 只。根据预实验，脓毒血症组腹腔注射脂多糖（10 mg/kg）构建幼鼠脓毒血症动物模型[3]。 建模成功后，治疗组于60 min 后腹腔注射参附注射液10 mL/kg[4]，其他各组腹腔注射10 mL/kg 0.9% NaCl。

1.4 标本采集 各组于6 h、12 h，10%水合氯醛麻醉后迅速切开腹部，眼球采集血样并取肝组织。

1.5 肝组织病理学改变 肝组织标本进行脱水、透明和浸蜡，石蜡包埋，切片，烘干，应用HE 染液染色，封片，贴上标签，显微镜下进行观察。

1.6 血清ALT、AST、 肝组织TNF-α、 乙酰胆碱水平、乙酰胆碱转移酶活力测定 生化仪分析结果测定血清ALT、AST，免疫组化检测肝组织TNF-α,分别依据Ach 测定试剂盒、ChAT 测定试剂盒的操作说明书操作测定肝组织Ach 水平、ChAT 活力。

1.7 统计方法 应用SPSS 19.0 软件进行统计分析。计量资料用（x±s)表示。样本均数比较用单因素方差分析。 两组资料之间相关性分析釆用皮尔森相关分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组幼鼠肝脏病理变化 Ctrl 组肝细胞的病理形态正常。在6 h 时LPS 组肝组织出现肝细胞水肿样变、炎性细胞浸润、炎性细胞坏死；在12 h 时肝细胞进一步水肿，炎症细胞进一步增多，坏死进一步加重。SFI 组无论是6 h 还是12 h 肝细胞水肿情况、 炎性细胞浸润数量、 坏死程度均较LPS 组减少。 见图1。

图1 各组幼鼠肝脏病理变化

2.2 各组幼鼠ALT、AST 及肝组织中的TNF-α 比较 与Ctrl 组相比，LPS 组ALT、AST 及肝组织中的TNF-α 明显升高 （P＜0.01），12 h 亚组升高更明显（P＜0.01）。 与LPS 组相比，SFI 组ALT、AST 及肝组织TNF-α 均明显降低（P＜0.01），但仍高于Ctrl 组（P＜0.01）。 见表1。

表1 各组幼鼠ALT、AST，肝组织TNF-α 比较（n=8，x±s）

2.3 各组幼鼠肝组织乙酰胆碱（Ach）水平、乙酰胆碱转移酶（ChAT）活力比较 与Ctrl 组相比，LPS 组肝组织Ach 水平、ChAT 活力明显降低（P＜0.01），12 h 亚组降低更明显（P＜0.01）。与LPS 组相比，SFI组肝组织Ach 水平、ChAT 活力均明显升高 （P＜0.01），但仍低于Ctrl 组（P＜0.01）。 见表2。

表2 各组幼鼠肝组织Ach 水平、ChAT 活力比较（n=8，x±s）

2.4 肝组织TNF-α 分别与Ach 及ChAT 的皮尔森相关分析结果 肝组织6 h、12 h 时TNF-α 与Ach、ChAT 活力皮尔森相关性分析，结果显示均呈负性相关（P＜0.01）。 见表3。

表3 肝组织TNF-α 分别与Ach 及ChAT 的皮尔森相关分析结果

3 讨论

脓毒血症是儿科重症监护病房、儿科急诊及新生儿重症监护病房中常见的危急重症之一[5]。 据报道全球每年大约有120 万名儿童和300 万名新生儿成为脓毒血症患者[6]。 儿童及新生儿免疫系统不完善，患有脓毒血症是对其生命极大的威胁。 肝脏作为最大的解毒器官，调节机体的代谢，而脓毒血症作为全身炎症反应，肝脏是其靶器官之一。 急性肝损伤发生在脓毒血症患者中也屡见不鲜。 曹瑛等报道脓毒血症急性肝损伤发病率为28.15%（96/341）[7]。Kobashi H 等报道急性肝损伤发病率占34.7%[8]。 故此，积极治疗脓毒血症急性肝损伤有着重要的临床意义。

“炎症因子瀑布”学说是脓毒血症造成器官损伤的学说之一。肿瘤坏死因子α（TNF-α）作为炎性因子之一，启动着脓毒血症的炎症反应，进而形成“因子风暴”。脓毒血症时TNF-α 明显升高，TNF-α升高的程度是影响脓毒血症患者预后的危险因子之一[9]。TNF-α 作用于肿瘤坏死因子受体1，两者结合形成肿瘤坏死因子受体1 信号复合体，该复合体进一步作用于核因子-κB 信号通路，激活核因子-κB，使其从胞浆内转移至胞核内，与启动子结合，促进TNF-α 表达增加，加剧炎症反应，引起肝细胞坏死、凋亡，造成肝损伤[10-11]。 本研究中脓毒血症组肝脏TNF-α 表达明显增加，参附注射液治疗组则降低。

胆碱能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway， CAP)自提出来后越来越多的学者发现其在治疗脓毒血症中有着重要的临床价值。 该通路主要由副交感神经、乙酰胆碱(Ach)及α7 烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)组成。 炎症反应时副交感神经受到刺激，释放乙酰胆碱，释放的乙酰胆碱与α7nAChR 结合，再作用于核因子-κB 信号等通路，进一步抑制炎症因子，调控着炎症反应过程[12]。 我国传统中医利用电针足三里穴来刺激副交感神经， 激活胆碱能抗炎通路， 证实可抑制炎症因子TNF-α 分泌，减轻脓毒血症急性肝损伤等[13]。

乙酰胆碱是通路中主要递质，动物实验显示在内毒症老鼠体外补充乙酰胆碱后TNF-α 的免疫活性下降，并且巨噬细胞释放TNF-α 减少，发挥了抗炎作用[14]。 在体外乙酰胆碱易被水解，卡巴胆碱作用与乙酰胆碱相似，稳定性好。 有研究者体外补充卡巴胆碱，实验结果显示卡巴胆碱通过激活胆碱能抗炎通路，改善脏器血液灌流，对氧自由基的生成进行抑制，保护脏器[15]。 α7nAchR 是通路中主要受体，起着核心作用[16]。实验显示应用α7nAchR 受体激动剂可抑制炎症反应，肝脏KC 细胞作为巨噬细胞的一种，细胞膜上同样存在α7nAchR 受体，动物实验显示烟碱可以抑制肝脏KC 细胞上TNF-α的释放，抑制炎症过程[17-18]。

胆碱和乙酰辅酶A 在乙酰胆碱转移酶(ChAT)的作用下合成乙酰胆碱。 作为乙酰胆碱的合成酶，乙酰胆碱转移酶存在于胆碱能神经末梢， 可由非神经元细胞分泌,其活性的高低间接提示了机体内乙酰胆碱的水平， 维持着机体乙酰胆碱的稳态[19]。本研究中脓毒血症组的乙酰胆碱转移酶活力明显降低，乙酰胆碱水平明显下降。

参附注射液由红参 （主要成分为人参皂苷）、附子（主要成分为乌头类生物碱）两味中药按照现代方式配制而成，其中人参皂苷可抑制炎症反应、抑制细胞凋亡、调节免疫反应、改善脏器的代谢从而发挥对多个脏器的保护作用。 而乌头类生物碱有抗炎、抑制细胞凋亡、镇痛等作用，其毒副作用主要是对心脏的损害[20-21]。 参附注射液是按照现代工艺将人参皂苷和乌头类生物碱相配伍，大大减少乌头类生物碱的毒副作用而发挥两者有利药效。在临床上参附注射液应用于多个系统的病种，如心血管系统的心力衰竭、呼吸系统的肺损伤、消化系统的肝损伤、神经系统的脑损伤、休克等疾病[20，22]。 随着参附注射液在成人多个系统疾病的应用，发现其副作用小，目前在儿科疾病中也得到多项临床应用，如支气管肺炎、肾病综合征、川崎病等[23-24]。钟勇等[25]报道参附注射液应用于脓毒血症急性肝损伤患者可改善患者肝功能ALT、AST、TBIL 水平，降低炎症因子TNF-α、IL-1、IL-10 水平，达到治疗作用。 本研究中参附注射液治疗组血清ALT、AST 同样明显降低，肝组织TNF-α 表达降低，动物层面上证实了参附注射液对脓毒血症急性肝损伤具有保护机制。

参附注射液作为我国传统中药，含有生物碱成分，笔者假设其类似于烟碱、卡巴胆碱等作用于胆碱能抗炎通路。 本研究中参附注射液治疗组乙酰胆碱水平升高、乙酰胆碱转移酶活力增加，同时发现肝组织TNF-α 的释放与Ach、ChAT 活力呈明显的负相关性， 故此参附注射液作用于胆碱能抗炎通路增加乙酰胆碱转移酶活力， 升高乙酰胆碱水平，降低炎症因子TNF-α，保护肝脏。 本研究丰富了参附注射液的临床应用理论依据， 对推广参附注射液的应用有一定的临床意义。