缺血再灌注下调脑血管内皮细胞经典Wnt 信号通路的分子机制

曹杰，赵强，黄旭华

（1.江西省赣南医学院第一附属医院神经内科，赣州 341000；2.江西省赣州市赤土卫生院内科，赣州 341400）

脑卒中，也称脑中风，是脑部局部受损而出现的血管疾病，是由血管堵塞、破裂引起脑缺氧，出现病变或坏死症状的一种疾病[1-2]。 脑卒中具有发病率高、致死致残率高和复发率高的特点。 脑卒中是我国居民死亡和残疾的首要原因之一， 每年大约有270 万新发患者，且呈逐年上升趋势[3]。 缺血性脑血管病是指局部脑组织由于供血障碍发生的变性、坏死或者一过性的功能丧失性疾病，是神经系统常见疾病之一，好发于老年人群，且致残率与病死率均较高。 引起缺血性脑血管病的原因包括动脉硬化、血管炎、先天性血管病、外伤、药物血液病等。 临床常见症状包括单侧面部麻木或肢体麻木、无力、语言障碍、眩晕伴呕吐、既往少见的严重头痛、意识障碍或抽搐等。 血脑屏障高度选择性地输送血液中的有益物质进入大脑， 同时严格限制血液中的有害物质通过， 从而保持大脑内环境的稳态及中枢神经系统的稳定[4]。 急性缺血性脑卒中患者脑部缺血经灌注后将破坏血脑屏障， 血液成分中炎症因子分泌更加加重症状[5]。 近年来，抑制缺血再灌注导致的血脑屏障损伤已成为治疗脑卒中的新思路。 深入探索缺血性脑卒中之后血脑屏障功能的分子调控机制， 开发具有应用前景的新颖蛋白或分子药物，有利于临床治疗脑卒中。 故本研究以IL-1β、TNF-α、IL-6 处理脑血管内皮细胞，找到引起Wnt 通路受抑的因子， 为治疗脑缺血损伤研发蛋白或分子药物提供方向。

1 材料及方法

1.1 实验试剂与仪器 清洁雄性大鼠购自江西省动物实验中心(重量180～210g)，ICAM-1 和VCAM-1及β-catenin、cyc-lin D1 兔抗大鼠抗体购于博奥森生物技术有限公司，PCR 试剂盒、逆转录试剂盒购于抚生实业有限公司。实验所用培养试剂购于裕恒丰科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型构建 线栓法构建缺血再灌注小鼠模型。 刮掉小鼠颈部毛发，切开皮肤，暴露各动脉，在颈外动脉剪出小口，将线栓从颈外动脉插进血管至颈总动脉，剪断颈外动脉，线栓掉头插进颈内动脉，避开翼腭动脉插入。 最后用沾有生理盐水的无菌纱布覆盖皮肤切开。 缺血40 min 后立即取出线栓，缝合皮肤，形成缺血再灌注模型。将模型随机分为四组， 分别是对照组、IL-1β 组、TNF-α 组、IL-6组， 对照组不用任何药物处理，TNF-α 组用10 nmol/L 的TNF-α 处理，IL-1β 组用10 nmol/L 的IL-1β 处理，IL-6 组用10 nmol/L 的IL-6 处理，取大鼠脑组织， 分离出脑血管内皮细胞， 置入RPMI1640 培养基(100 mL/L 胎牛血清)，于培养箱中培养，观察培养情况，培养液一日一换，长满至80%左右开始消化传代。

1.2.2 蛋白印迹检测脑组织Wnt 通路β-catenin、cyc-lin D1 表达 提取各组样本的总蛋白并测定总蛋白浓度， 电泳、 凝胶后转移至PVDF 膜， 放进TBST 液中封闭2 h，添加一抗(β-catenin 单克隆抗体1∶1000，cyc-lin D1 多克隆抗体1∶1000，β-actin单克隆抗体1∶1000)。孵育过夜，洗膜后添加二抗(1∶5000)孵育1 h，洗膜后用胶片曝光。

1.2.3 RT-PCR 检测ICAM-1 及VCAM-1mRNA 水平 提取总RNA 逆转录。 用Primier 5.0 引物设计软件设计ICAM-1、VCAM-1 及GADPH 引物。 PBS漂洗、裂解、离心收集上清液RNA，清洗、离心、挥干样品加入适量DEPC 水充分沉淀后打散备用。抽提的RNA 反转录得到cDNA， 以cDNA 为模板扩增。根据所得的Ct 均值，通过2-ΔΔCt法计算ICAM-1及VCAM-1 相对表达量（ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=Ct实验组-Ct对照组)。 见表1。

表1 引物序列

1.2.4 Western blot 法检测ICAM-1 及VCAM-1 蛋白水平 提取总蛋白并测定浓度。 电泳、转膜封闭后，分别加入一抗(1∶1000)ICAM-1 及VCAM-1,4℃孵育过夜。 加入二抗(1∶5000)ICAM-1 及VCAM-1室温孵育,ECL 液显色，X 片显影、 定 影。 采用Image J 图像分析测定Western blot 条带灰度值，结果以目的蛋白与GADPH 灰度值的比值作为目的蛋白表达相对水平。

1.3 统计学方法 SPSS 分析数据， Skewness 和Kurtosis 检验资料正态分布， 计量资料采用leneve检验方差齐性，以(x±s)表示。 两组比较采用独立样本t检验，P<0.05 为差异显著。Image J 处理蛋白表达量图片，计算相对表达量。

2 结果

2.1 各组β-catenin、cyc-lin D1 水平 较之对照组，IL-1β 组和IL-6 组的β-catenin、cyc-lin D1 水平无明显差异(P>0.05)，TNF-α 组β-catenin、cyclin D1 水平下调(P<0.05)，TNF-α 可抑制Wnt 通路蛋白表达，见图1、图2。

图1 各组β-catenin、cyc-lin 水平

图2 各组Wnt 通路蛋白相对表达量

2.2 ICAM-1 及VCAM-1mRNA 水平 较之对照组，IL-1β 组 和IL-6 组 的CAM-1 及VCAM-1 mRNA 水平无明显差异(P>0.05)，TNF-α 组ICAM-1 及VCAM-1 mRNA 水平上调(P<0.05)。 见图3。2.3 ICAM-1 及VCAM-1 蛋白水平 较之对照组，IL-1β 组和IL-6 组ICAM-1 及VCAM-1 蛋白含量没有明显差异 (P>0.05)，TNF-α 组ICAM-1 及VCAM-1 蛋白水平上调(P<0.05)。 见图4、图5。

图3 各组ICAM-1 及VCAM-1mRNA 水平

图4 各组ICAM-1 及VCAM-1 蛋白水平

图5 各组ICAM-1 及VCAM-1 相对表达量

3 讨论

在脑缺血再灌注损伤中，PI3K/Akt 信号通路可以通过调控GSK-3β 进而影响Wnt/β-catenin 信号通路，这为深入研究PI3K/Akt 和Wnt/β-catenin信号通路在缺血性脑损伤中的协同作用机制提供重要线索。

本研究通过构建脑缺血灌注模型， 分离出大鼠脑组织，经不同条件培养后检测到的结果，表明了TNF-α 可以下调Wnt 通路信号表达，能够引起ICAM-1 和VCAM-1 水平升高， 而IL-1β 和IL-6未有明显影响， 说明TNF-α 是引起脑缺血灌注损伤的原因之一。

脑缺血再灌注损伤作为预后效果不佳的首要因素，其进程复杂，涉及多个病理环节，多受氧自由基和炎症细胞影响， 炎症因子合成及分泌引起炎症，是导致损伤的首要因素[6]。IL-1β 作为炎症因子具有破坏机体组织功能的作用。 IL-6 涉及体液免疫，是过敏反应首要因素。TNF-α 会导致血管损伤，加重组织液积聚程度，这三种炎症因子对于疾病组织的修复影响较大[7]。 细胞黏附因子为膜表面蛋白，表达受机体各种反应影响，可增加细胞间黏附性，在炎症中具有重要影响[8]。 其中ICAM-1 和VCAM-1 属免疫球蛋白超家族黏附分子， 主要表达在血管内皮细胞表面[9]。 一般ICAM-1 和VCAM-1 在机体组织中含量低，并不能明显检测到，处于低表达状态，但当脑组织出现缺血状况，局部组织缺氧致损伤，损伤的组织将分泌大量炎症因子，炎症因子堆积， 加重损伤程度， 并提高ICAM-1、VCAM-1 水平[10]，ICAM-1、VCAM-1 的急剧增加会促进细胞黏附， 最终同样导致堵塞， 血液流通受阻，加重缺血状况和损伤程度[11]，同时白细胞分泌物会导致出血症状，加剧局部缺血程度。 以上是造成脑缺血再灌注引起损伤的原因[12-13]。

此次研究在分子水平发现TNF-α 下调Wnt通路蛋白水平，并上调ICAM-1 和VCAM-1 水平，降低脑缺血疾病患者TNF-α 水平有望提高患者预后状况。 赵德福等[14]、姚立岩等[15]、蒋月丽等[16]和陈博威等[17]的研究表明TNF-α 水平越高，大鼠脑缺血灌注损伤的程度就越大，不利于脑组织的修复，而且TNF-α 还能加重炎症反应， 加深脑血管内皮损伤， 进而导致血栓的形成， 不利于脑部血液循环；TNF-α 水平可以反映脑卒中患者的严重程度，对衡量患者预后效果具有极高的参考价值； 降低TNF-α 水平可以有效地修复脑组织的损伤。 本研究说明Wnt 通过影响TNF-α 能够上调ICAM-1和VCAM-1 水平， 导致大鼠缺血脑组织脑屏障功能下降， 这是TNF-α 影响缺血脑损伤的一个通路机制， 了解TNF-α 引起通路蛋白水平变化的机制将对改善脑缺血症状有指导意义， 降低TNF-α 在组织的水平、激活Wnt 通路，将有望作为治疗缺血脑卒中患者的一个研究方向。

综 上 所 述，TNF-α 可 下 调Wnt 通 路， 上 调ICAM-1 和VCAM-1 水平，降低脑屏障功能。 降低脑缺血组织内TNF-α、 激活Wnt 通路蛋白合成是改善缺血脑损伤的一个方向， 对于研制分子特异性药物具有指导意义。