Caspase-1在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者血浆中的表达水平及其预后意义

朱江，王占伟，龙悦，于庆生

中国人群慢性HBV感染的总体感染率为6.1%，约占全世界HBV病例的1/3[1]。HBV感染导致的代偿性肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌，导致每人约90万例死亡年[2-3]。HBV感染急性加重的情况并不罕见，每年的累积发病率为10～30%[4]。慢加急性肝功能衰竭(ACLF)是终末期肝病的常见模式，慢性乙型肝炎感染患者经常发生这种疾病，随着疾病的快速发展，造成很大的疾病负担。由于治疗选择有限，结果通常较差。在ACLF患者中使用肝移植，但是此过程成本高昂，成功率也各不相同。早期干预可以提高生存率，这增加了对早期诊断和预后标志物的新需求。促炎蛋白半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase)-1是裂解IL-1β和IL-18的前体，产生相应的成熟细胞因子并引起细胞凋亡，并向细胞外部释放胞质内容物，从而引起炎症[5]。因此，caspase-1是驱动宿主对感染，损伤和疾病反应的关键炎症介质。Caspase-1在体内或体外各种肝病的发病机理中起着重要作用，不仅作为炎症介质，而且作为肝细胞凋亡介质[6]。caspase-1的激活与Fas介导的细胞凋亡和TNF-α诱导的肝细胞损伤密切相关，而caspase-1活性的抑制基本上抑制了Fas诱导的死亡[7]。研究表明IL-18也可以通过caspase-1非依赖性途径从FasL刺激的巨噬细胞中分泌，并导致小鼠急性肝损伤[8]。本研究拟探讨Caspase-1在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者血浆中的表达水平及其预后意义，为ACLF的早期诊断及治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2017年1月至2019年11月，本院收治HBV-ACLF患者130例为病例组，HBV-ACLF的诊断符合中华医学会肝病学分会《慢性乙型肝炎防治指南(2015版)》，根据该指南将130例HBV-ACLF患者分为分为HBV-ACLF早期组52例、HBV-ACLF中期组44例、HBV-ACLF晚期组34例；根据预后情况分为生存组101例、死亡组29例。同期选择本院健康体检人群130例为对照组。该研究得到本院医学伦理委员会的批准，并获得每位患者的书面知情同意。

病例纳入标准：①符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[9]；②患者均为乙型肝炎表面抗原阳性(HBsAg)持续6个月；③HBV DNA载量升高且肝功能异常。

病例排除标准：①甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎；②肝细胞癌，酒精性肝病，代偿性肝硬化；③药物性肝损伤。

1.2 方法

1.2.1 各项指标测定

病例组及对照组清晨空腹及肱静脉抽血，分离血清，贝克曼AU-680全自动生化分析仪(美国库尔特公司)以及CA-7000全自动凝血分析仪(希森美康)测定白蛋白(Albumin，ALB)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)、HBV-DNA、总胆红素(total bilirubin，TBil)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三脂(Triglyceride，TG)、凝血酶原时间(Prothrombin time，PT)、凝血酶原活动度(prothrombin activityprothrombin time activity，PTA)；终末期肝病模型(Model for end-stage liver disease，MELD)标准评价HBV-ACLF患者疾病严重程度。

使用TRIzol试剂从血浆中分离总RNA，然后使用Prime Script First Strand cDNA Synthesis Kit将总共1 μg RNA反转录为cDNA。引物由上海生工科技合成，序列见表1，反应体系见表2。定量PCR仪器检查caspase-1水平(SLAN-96P，上海宏石全自动荧光定量PCR仪)，反应条件是50 ℃ 2分钟，95 ℃ 5分钟，然后95 ℃ 15秒，和60 ℃ 30秒，40个循环，然后是55 ℃下41个循环4秒。用2-ΔΔCt方法以GAPDH基因为对照计算mRNA水平。

表1 GAPDH、caspase-1引物序列

表2 RT-PCR反应体系

1.2.2 随访

研究对象入组时均无肝硬化、腹水、肝肾综合症、上消化道出血、糖尿病、肝性脑病、电解质紊乱发生。每位研究对象的随访起始日期为确诊为HBV-ACLF后第1天，随访截止日期为确诊为HBV-ACLF后第365天；本研究的结束时间为截止日期为2020年12月31日。随访内容为：肝硬化[9]、肝肾综合症[9]、上消化道出血[9]、糖尿病[10]、肝性脑病[9]、电解质紊乱、死亡的发生情况；若有上述事件发生即为发生不良预后结局。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 对照组、病例组一般临床资料比较

表3可见，与对照组比较，病例组ALT、AST、HBV-DNA、TBIL、PT、TC、TG水平升高，PTA、ALB、MELD水平降低(P<0.05)；而两组性别、年龄、病等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 对照组、病例组一般临床资料情况比较

2.2 不同组别Caspase-1表达水平比较

与对照组比较，病例组Caspase-1表达升高(P<0.05)；生存组比较，死亡组HBV-ACLF患者Caspase-1表达升高(P<0.05)；与早期组比较，中期组、晚期组HBV-ACLF患者Caspase-1表达升高，随着HBV-ACLF患者病情严重程度的增加，HBV-ACLF患者Caspase-1表达逐渐升高(P<0.05)(表4)。

表4 不同组别Caspase-1表达水平比较

2.3 Caspase-1与各指标的相关性分析

Caspase-1与AST、ALT、TBIL、HBV-DNA、PT、MELD、TC、TG、PTA正相关，与PTA、ALB、MELD负相关(P<0.05)。

2.4 不同Caspase-1水平HBV-ACLF患者比较

表5可见，当血浆Caspase-1水平≥9.58(均数)时，HBV-ACLF患者肝硬化、肝肾综合症、上消化道出血、糖尿病、肝性脑病、电解质紊乱、死亡发生率高于血浆Caspase-1<9.58的HBV-ACLF患者(P<0.05)。

表5 不同Caspase-1水平HBV-ACLF患者不良预后结局比较 [n(%)]

2.5 HBV-ACLF患者救治结局单因素分析

单因素分析结果显示，当年龄≥46岁、ALB<22.34 g/L、ALT≥380.82 U/L、AST≥447.74 U/L、HBV-DNA≥7.79 copies/mL、MELD≥27.36分、Caspase-1≥2.48时， HBV-ACLF患者不良救治结局比例更高(P<0.05)(表6)。

表6 不同特征HBV-ACLF患者救治结局比较 [n(%)]

2.6 HBV-ACLF患者救治结局多因素Cox回归分析

表7可见，以HBV-ACLF患者是否死亡为应变量(是=1，否=0)，单因素分析有意义因素为自变量进行Cox回归分析，结果发现高水平Caspase-1、HBV-DNA、MELD均为HBV-ACLF患者死亡的危险因素(HR=2.484、1.947、2.086，P<0.05)。

表7 HBV-ACLF患者发生不良预后结局事件Cox回归分析

3 讨论

Caspase-1与许多疾病状况相关，包括神经退行性疾病、精神病、癌症、哮喘甚至伤口愈合。Caspase-1是一种多功能蛋白，可以与细胞膜上的钙黏着蛋白结合以调节细胞粘附或可以转运至细胞核，在该细胞中它起转录共激活因子的作用并调节数百个基因。在肝病中，已确定Caspase-1的激活是肝癌进展的主要因素。先前的研究已经证明，HBV X(HBx)蛋白和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)可以作为致病因子，参与Caspase-1的调节和诱导，从而促进HBV诱导的肝癌发生。本研究发现，与对照组比较，病例组Caspase-1表达水平升高；与生存组比较，死亡组Caspase-1表达水平升高；与早期组比较，中期组、晚期组Caspase-1表达水平升高，随着HBV-ACLF患者病情严重程度的增加，Caspase-1表达水平逐渐升高(P<0.05)。这说明，HBV-ACLF患者血浆Caspase-1表达水平升高，且与疾病严重程度有相关性。

先前的研究报道，从急性和慢性肝炎、乙肝相关肝硬化、ACLF、肝细胞癌，肝损伤的严重程度逐渐升高。从急性和慢性肝炎、乙肝相关肝硬化、ACLF、肝细胞癌，血清Caspase-1水平也逐渐升高，并且在乙肝相关肝硬化、ACLF、肝细胞癌期，Caspase-1与ALT或AST呈正相关[11]。我们推测，血清Caspase-1升高与CHB、ACLF、和HBLC期肝细胞坏死有关。本研究也发现，Caspase-1与AST、ALT、TBIL、HBV-DNA、PT、MELD、TC、TG、 ALB、PTA相关(P<0.05)。这与上述研究一致。在瞬时HBV感染细胞模型中发现了较高的细胞内Caspase-1水平，但其在细胞外上清液中的水平并未改变，这与其在临床样品中的分布不一致。通常，HBV对感染的肝细胞无致病性，但在HBV感染期间造成肝损害的罪魁祸首主要是对病毒感染的肝细胞的适应性免疫攻击[12]。细胞实验表明，通过LDH释放测定和FACS在短暂的体外HBV感染细胞模型中没有发现明显的细胞死亡，因为该细胞模型只是一项体外实验，并且缺乏HBV诱导的免疫攻击[13]。因此，体外HBV感染细胞模型中完整的细胞膜可能不利于Caspase-1释放到细胞外空间。这也间接说明，细胞外高水平的Caspase-1对肝细胞有损坏作用。

预后分析显示，当血浆Caspase-1水平≥9.58时，HBV-ACLF患者肝硬化、肝肾综合症、上消化道出血、糖尿病、肝性脑病、电解质紊乱、死亡发生率明显升高(P<0.05)；高水平Caspase-1、HBV-DNA、MELD均为HBV-ACLF患者死亡的危险因素。这提示，高水平血浆Caspase-1是HBV-ACLF患者预后不良的威胁因素。近期研究发现，Caspase-1是自然免疫系统的重要组成部分，可以用作抗感染治疗各种炎性疾病的治疗靶标[14]。HBV感染可发展为无症状携带者状态或发展为 ACLF，并且Caspase-1在HBV相关肝病的不同阶段起着复杂的作用[15-18]。Caspase-1诱导包括IL-1β和IL-18在内的促炎性细胞因子成熟，从而参与先天性免疫反应和肝组织动态平衡。HBeAg抑制Caspase-1的活化和促炎细胞因子如IL-18的产生，从而抑制机体的抗病毒免疫反应，进而促进慢性HBV感染状态[19]。肝纤维化也可由Caspase-1直接或间接调节，直接调节方式主要通过Caspase-1在肝星状细胞(HSCs)中的表达来促进肝纤维化，而诱导IL-1β和IL-18调节肝纤维化的间接途径[20-21]。对于肝癌，Caspase-1在肝癌组织中显着上调，并且Caspase-1的水平越高，癌症进展越快。对于肝癌的预后，研究表明，caspase-1的高表达与肝癌切除后患者的生存呈负相关。这与本研究中的预后结果一致。

综上所述，HBV-ACLF患者血浆Caspase-1表达水平升高，且与疾病严重程度及预后有一定相关性。