胃癌发生过程中Survivin促血管生成作用的研究

潘存伟　林瑶光

胃癌发生过程中Survivin促血管生成作用的研究

潘存伟林瑶光

目的探讨胃癌发生过程中Survivin促进血管生成的作用。方法用免疫组化方法检测慢性非萎缩性胃炎、胃癌癌前病变、胃癌组织中Survivin的表达及MVD情况，分析Survivin的表达与胃癌临床病理参数之间的关系，分析Survivin的表达与MVD的关系。结果Survivin蛋白在胃癌组织中的表达率为71.67%，显著高于慢性非萎缩性胃炎的3.33%及胃癌前病变组织的30.00%，三组间差异有统计学意义（P<0.05）；Survivin蛋白表达与肿瘤分化程度、胃癌局部浸润、淋巴结转移和TNM分期有关（P< 0.05）。Survivin表达阳性的胃癌组织及癌旁组织中MVD表达高于Survivin表达阴性的胃癌组织及癌旁组织（P<0.05）。结论Survivin的过度表达是胃癌发生过程中的早期事件，可能可以促进胃癌血管形成。

胃癌；Survivin；微血管密度；癌前病变

【Abstract】Objective To explore the expression of Survivin and its relationship with tumor angiogenesis in gastric cancer.Method The expression level of Survivin and microvessel density(MVD)in chronic non-atrophic gastritis,precancerous and cancer tissues were detected by immunohistochemistry.The relationship between Survivin and clinicopathological parameters of gastric cancer and the relationship between Survivin and MVD were also analyzed.Results The expression level of Survivin in gastric cancer tissue was 71.67%which was significantly higher than that in chronic non-atrophic gastritis(3.33%)and precancerou tissue(30.00%)(P <0.05).The expression levels of survivin were correlated with degree of tumor differentiation,regional lymph node metastasis,TNM staging and serosal invasion(P<0.05).The MVD in Survivin-positive carcinoma and carcinoma-adjacent tissues were higher than those in Survivin-negative tissues(P<0.05).Conclusion The overexpression of Survivin is an early event in the development of gastric cancer and likely involved in the aniogenesis of gastric cancer.

【Key words】Gastric cancer;Survivin;Microvessel density;Precancerous lesions

肿瘤的生长、浸润是肿瘤转移的前提，肿瘤新生血管的形成是其中的重要原因，如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过2 mm3。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成员之一，可以调节细胞周期，在细胞周期的G2/M期特异性表达[1]，可以与细胞凋亡关键蛋白caspase-3和caspase-7结合，抑制其激活从而抑制细胞凋亡[2]。近年来发现Survivin与血管形成有关[3]，随着其表达量的增加，微血管密度（Microvessel density，MVD）可能呈上升的情况，但在胃癌中的相关研究较少。本研究通过检测慢性非萎缩性胃炎、癌前病变、胃癌组织中Survivin的表达量及与微血管密度的关系，探讨Survivin促血管生成在胃癌发生过程中的作用，为胃癌的治疗寻找新的方向。

资料与方法

一、临床资料

本研究选取我院2003年8月至2006年8月胃镜活检标本和胃癌外科手术标本存档蜡块，标本均经病理确诊，所有患者均未接受放疗、化疗或其他肿瘤相关治疗。胃癌60例，其中男34例，女26例；年龄31～85岁，平均（54±2.5）岁；根据病理组织学表现将胃癌分化程度分为两组：①高、中分化组29例；②低、未分化组31例；TNM分期：Ⅰ-Ⅱ期36例，Ⅲ-Ⅳ期24例。胃癌癌前病变30例，男16例，女14例；平均为（58.8±3.4）岁；中-重度肠化生19例和异型增生11例。慢性非萎缩性胃炎30例，男15例，女15例；平均为（53.5±2.2）岁。

二、方法

1.试剂

Survivin兔抗人多克隆抗体购自美国Zymed公司。鼠抗人CD34单克隆抗体及SP免疫组织化学染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。

2.免疫组化SP染色法

用磷酸盐缓冲洗液（PBS）代替一抗作阴性对照，用已知阳性胃癌切片作为阳性对照，采用两步法进行：蜡块常规切片，脱蜡至水，将组织切片放置入高压锅内进行抗原修复，再将切片放入3%H2O210～15 min，以阻断内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗后，加一抗放入适量水以免干燥，套上薄膜25℃室温1～2 h。PBS洗3次后，加二抗，盖上盖子孵化30 min，孵化后揭开盖子，PBS洗3～4次。DAB显色，苏木素复染，进行相应处理后封片，光镜下进行观察。

3.结果判定

免疫组化染色阳性反应为黄-棕色颗粒，且明显高于背景染色。采用两人双盲法观察切片，由两位高年资病理科医师分别对免疫组化结果进行判断。在10×40倍光镜下观察10个阳性细胞较多的视野，计算其平均数，每个视野计数100个细胞，共计1 000个细胞。根据参考文献[4-5]，Survivin阳性标准为着色位于细胞质（多见于胞浆），细胞质染成淡黄色至黄棕色为阳性细胞。计算染色阳性细胞占观察细胞的百分比，阳性细胞占肿瘤细胞数<30%为（＋），31%～51%为（＋＋），>50%为（＋＋＋）。

4．CD34检测及MVD计数

参照Weidner等[6]报道的方法进行，CD34阳性以血管内皮细胞呈棕色或棕黄色。首先是在低倍镜下全面观察切片，确定肿瘤内血管密度最高部位，然后再于高倍镜下观察，与周围组织成分明显区别的内皮细胞或者细胞丛作为1个血管计数，记录5个视野内的微血管数，取平均值为该例的MVD值，镜下呈棕黄色或棕褐色的内皮细胞或细胞丛为1个微血管，只要结构不相连，其分支结构也作为1个血管计数，而厚壁血管或管径大于50 μm的血管不计数。

三、统计学处理

应用SPSS 16.0统计软件，各组间Survivin表达的差异，胃癌组织中Survivin的表达与胃癌临床病理参数的关系采用χ2检验或Fisher精确检验分析，各组MVD比较使用方差检验或t检验分析，P< 0.05为差异有显著性。

结果

一、Survivin在各组胃黏膜病变中的表达

Survivin在30例慢性非萎缩性胃炎中1例表达，阳性率为3.33%；30例胃癌前病变中9例表达，阳性率为30.00%；60例胃癌组织中43例表达，阳性率为71.67%。Survivin在慢性非萎缩性胃炎、胃癌前病变、胃癌组织中的阳性率均逐渐上升，三组间差异有统计学意义（χ2=41.126，P=0.000），两两对比差异有统计学意义（P<0.05），见图1。

图1　 Survivin在各组胃黏膜病变中的表达

二、Survivin在胃癌中的表达与临床病理参数的关系

Survivin蛋白在胃癌低、未分化组的表达率为87.1%（27/31），显著高于高中分化组的55.17%（16/ 29）（P<0.05）；在有淋巴结转移组阳性表达率为92.59%（25/27），显著高于无转移组的54.55%（18/33）（P<0.05）；在TNM分期Ⅲ+Ⅳ期阳性表达率95.83%（23/24），显著高于Ⅰ+Ⅱ期55.55%（20/36）（P<0.05）；浸润累及浆膜层组阳性表达率为85%（34/40），显著高于未累及组的45%（9/20）（P< 0.05）；Survivin蛋白表达阳性率与肿瘤大小无关。见表1。

表1　 Survivin在胃癌中的表达与临床病理参数的关系

三、MVD及与Survivin关系

癌组织中MVD为31.10±12.27，癌旁组织中为15.97±5.44，正常组织中为9.91±1.92，三者两两比较有统计学差异（F=62.04，P=0.000）；Survivin表达阳性的胃癌组织MVD为43.42±11.30，显著高于Survivin表达阴性胃癌组织的13.42± 1.14（t=10.87，P=0.000）；Survivin表达阳性的胃癌癌前病变组织MVD为18.61±7.40，显著高于Survivin表达阴性胃癌癌前病变组织的8.7±2.23（t= 5.677，P=0.000）。

讨论

Survivn是凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis protein,IAP）家族的成员之一，主要表达于胚胎和发育的胎儿组织，参与调节细胞的增殖和凋亡，是目前已知分子量最小的凋亡抑制因子，但也是抑制凋亡作用最强的因子[7]。研究表明，Survivin在大多数肿瘤中都可见表达[8-9]。郑超球等[10]发现Survivin在大肠腺瘤和腺癌中过度表达，提示Survivin过度表达是大肠上皮癌变过程的早期事件，可作为大肠癌发生早期阶段的分子标记物。胃癌同样也是一个多步骤的癌变过程：正常胃黏膜-慢性浅表性胃炎-萎缩性胃炎-中到重度肠化生或异型增生－胃癌，我们的研究结果表明Survivin在慢性非萎缩性胃炎中几乎无表达，而在胃癌及胃癌癌前病变中均为高表达，且胃癌中的表达显著高于胃癌癌前病变组织（P< 0.05）。这一结果也揭示了Survivin过度表达是胃黏膜上皮细胞恶性变的一个早期事件，当Survivin的表达升高时提示胃癌的发生。这与Da等[11]的结果一致。我们进一步的研究结果显示，Survivin与胃癌的临床病理参数也有关，与胃癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TMN分期均有关，提示Survivin与胃癌的预后有关，监测组织中Survivin的变化有助于帮助判断预后。

近年来研究表明，Survivin的表达与肿瘤血管形成有关。Chen等[12]在研究小细胞肺癌组织中Survivin与VEGF表达情况时发现两者的表达呈正相关。李曙霞等[13]发现Survivin在口腔鳞癌形成过程中参与了肿瘤的血管形成。MVD是反映肿瘤微血管生成程度的一个常用指标，是恶性肿瘤预后的独立判断指标[14]。我们的研究发现在胃癌组织中MVD的表达水平高于胃癌癌前病变组织及良性病变组织，Survivin表达阳性胃癌组织中MVD的表达水平高于其表达阴性胃癌组织，提示Survivin与胃癌组织的血管形成有关，这也可能是Survivin与胃癌预后有关的关键原因。新生血管的生成是一个复杂的过程，受到多种因素的影响，有研究表明胃癌组织中Survivin与VEGF的表达均升高[15]，也有研究表明Survivin可以作用于血管生成素-2发挥其促进血管形成的作用[16]。然而，Survivin在胃癌影响血管形成的具体机制尚未阐明，还需进一步研究。

综上所述，本研究结果显示Survivin与胃癌的发生发展有关，Survivin与胃癌肿瘤血管形成也有关，因而Survivin可能成为胃癌的一个有效治疗靶点。

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（本文编辑：姚永莉）

The expression of Survivin and its relationship with tumor angiogenesis in gastric cancer

PANG Cunwei,LIN Yao-gaung.
Department of Gerontological Gastroenterology,First Affiliated Hospital Guangxi Medical University,Nanning,Guangxi 530021

10.3969/j.issn.1672-2159.2016.02.002

530021广西医科大学第一附属医院老年消化内科

2016-01-11）