急性髓系白血病Galectin-1基因甲基化研究

罗雅月，尹朝晟，付翔杰，张魏，刘娟，谭潭

1.南华大学附属郴州市第一人民医院门诊部，湖南郴州 423000；2.南华大学附属郴州市第一人民医院检验医学中心，湖南郴州 423000

*论著*

急性髓系白血病Galectin-1基因甲基化研究

罗雅月1，尹朝晟2，付翔杰2，张魏2，刘娟2，谭潭2

1.南华大学附属郴州市第一人民医院门诊部，湖南郴州 423000；2.南华大学附属郴州市第一人民医院检验医学中心，湖南郴州 423000

目的 检测急性髓系白血病（AML）中Galectin-1基因的甲基化水平，探讨Galectin-1基因表达水平与启动子甲基化的关系。方法 选取2014年1月—2015年12月在该院门诊部治疗前AML骨髓54例、对照骨髓35例和治疗后完全缓解AML骨髓8例，采用采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)方法检测Galectin-1基因甲基化状态。 结果 Galectin-1基因在AML骨髓中的平均表达水平明显低于对照骨髓 （0.35±0.09）VS（0.87±0.22），在完全缓解AML骨髓中明显高于治疗前骨髓 （0.79±0.21）VS（0.33±0.11）；Galectin-1基因在AML骨髓的甲基化阳性率明显高于对照骨髓 (79.6%VS 17.1%)，Galectin-1基因的甲基化阳性率在完全缓解AML骨髓中明显低于治疗前骨髓 (12.5%VS 75.0%)；Galectin-1基因表达水平与其甲基化呈负相关。结论Galectin-1基因在AML中出现表达下调或缺失，与其启动子甲基化有关。

急性髓系白血病；Galectin-1；甲基化

白血病是最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的身体健康。研究表明，白血病的发生和发展是一个多因素、多步骤复杂的过程，涉及到相应的遗传学与表观遗传学方面的改变[1]。DNA异常甲基化在人类许多肿瘤中是比较常见的表观遗传学改变，也是导致基因表达变化主要原因之一[2-3]。通过逆转基因的甲基化状态也就是去甲基化，可以恢复相关基因的表达水平，是临床上靶向治疗的热点方向。因此，通过研究有关白血病的甲基化沉默基因，可有助于阐明白血病的发病分子机制，在临床上为白血病的防治提供新的靶标和研究思路。

半乳糖凝集素I（Galectin-1）是一种典型的真核细胞胞浆蛋白，Galectin-1在人体许多组织中均有表，其广泛分布说明它是一种多功能蛋白质，在细胞的多种生物学过程中起着重要的作用，研究发现，Galectin-1在糖类识别、细胞黏附、细胞生长、细胞凋亡等生物学活动中具有重要作用[4]；在许多肿瘤中，Galectin-1的表达均增高，与肿瘤的发生发展有关[5-6]。该研究选取2014年1月—2015年12月AML骨髓54例及对照组骨髓35例及经治疗后完全缓解的AML骨髓8例，通过检测Galectin-1在其中的表达水平和甲基化状态，探讨Galectin-1在AML发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

试剂DNA甲基化试剂盒 (EZ DNA Methylation-Gold Kit)。

1.2 骨髓样本

2014年1月—2015年12月在该院门诊部初治AML骨髓标本54例（其中男30例，女24例，年龄13～81岁），其中经治疗后完全缓解的AML骨髓标本8例 （其中男5例，女3例，年龄13～52岁），以及对照组骨髓标本35例（贫血及血小板减少病人，其中男20例，女15例，年龄20～56岁）均来自中南大学湘雅医院的门诊和住院病人。AML病人诊断均符合FAB诊断和分型标准。

1.3 骨髓标本的制备

取肝素抗凝骨髓液3 mL，用分层液分选单个核细胞，每一个标本均分成2份，冻存于-80℃冰箱，用于后续实验。

1.4 提取纯化DNA

甲基化特异性PCR（MSP-PCR）抽提骨髓细胞的基因组DNA，采用DNA甲基化检测试剂盒对待测的DNA进行重亚硫酸盐修饰并纯化。PCR反应条件设置如下：94℃5 min，1个循环；94℃ 30 s，48℃ 30 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃延伸8 min。反应结束后，取5 μL PCR产物于2.0%琼脂糖凝胶中进行电泳分离，紫外灯下观察并扫描图片。

1.5 统计方法

用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析，数据以均数±标准差（±s）表示，两组均数之间的比较采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Galectin-1基因在AML骨髓中的表达

Galectin-1基因表达水平在AML骨髓中明显低于对照组骨髓 （0.35±0.09）VS（0.87±0.22）（图 1，t=11.124，P= 0.000）。Galectin-1基因平均表达水平在完全缓解AML骨髓中明显高于治疗前骨髓（0.79±0.21）VS（0.33±0.11）（图1，t=9.512，P=0.000）。

图1 Galectin-1基因表达水平

2.2 Galectin-1基因在AML骨髓中的甲基化状态

AML骨髓 Galectin-1基因甲基化阳性率为79.6%（43/54），对照组阳性率为17.1%（6/35），AML骨髓甲基化阳性率明显高于对照组（χ2=33.510、P=0.000）。Galectin-1甲基化阳性率在治疗前AML骨髓为75.0%(6/8)，而在完全缓解AML骨髓为12.5﹪(1/8)，两者之间的差异有统计学意义（χ2=6.349、P=0.012）。

表1 Galectin-1基因在AML骨髓中的甲基化状态

3 讨论

DNA甲基化修饰是白血病发生发展过程中相当普遍的一种表观遗传学改变，它在白血病的发生发展过程中具有重要作用。寻找白血病的有关甲基化沉默基因，将有助于阐明白血病的发病分子机制以及寻找新的白血病治疗靶标。半乳糖凝集素(Galectin)是动物凝集素家族当中的一员，目前已发现的Galectin家族成员有14个，在人类中，至少有12种Galectin分子，它具有多种生物学功能，Galectin-1在在多种肿瘤细胞中高表达，临床上可作为许多肿瘤的分子靶标，具有调节细胞之间、细胞与基质之间的相互作用，参与细胞的增殖、分化和凋亡等[7]。研究发现，Galectin-1在胃癌中表达阳性率为63%，Galectin-1高表达与肿瘤的大小、分化程度、TNM分期、转移有关[8]。

研究发现，Galectin-1主要功能是通过阻断S/G2细胞周期，从而可以抑制肿瘤细胞的增殖，并诱导肿瘤细胞发生凋亡[9-10]。Galectin-1启动子区的碱基对大约有250个，其启动子区发生甲基化，是Galectin-1基因表达沉默的主要原因之一[11]。有研究发现，在T细胞白血病细胞中，检测到了Galectin-1基因启动子甲基化[12]。Galectin-1基因在结肠癌细胞株中出现甲基化，与细胞凋亡有关[13]。

为了解Galectin-1基因在AML中的表达水平及基因甲基化之间的关系，该研究选取初治和完全缓解的AML患者、正常对照为研究对象，检测Galectin-1基因的甲基化情况。结果表明，在正常对照组Galectin-1表达明显高于AML患者，经过治疗完全缓解后其表达量增加。而该基因甲基化状态情况则与之相反，AML中Galectin-1基因甲基化阳性率为81%，正常对照甲基化阳性率为14%，完全缓解期仍为阳性可能预示着复发。Galectin-1基因表达水平和甲基化之间存在负相关性，与上述研究报道一致。因此，该研究认为Galectin-1基因启动子区出现甲基化可能是导致该基因沉默的主要原因之一。

综上所述，在AML中，Galectin-1基因出现高甲基化导致其表达下调，Galectin-1基因作为一个候选的抑癌基因，其表达缺失在AML生发展过程中具有重要的作用。但由于临床上AML完全缓解的骨髓样本量较少，有关Galectin-1甲基化在AML治疗过程中的应用价值仍需进一步研究，扩大样本量有助于进一步明确Galectin-1与AML预后之间的关系，可为临床上提供一种监测AML预后与复发的标记物。

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[1]Wahlberg P,Lundmark A,Nordlund J,et al.DNA methylome analysis of acute lymphoblastic leukemia cells reveals stochastic de novo DNA methylation in CpG islands[J]. Epigenomics，2016，8(10)：1367-1387.

[2]Zhang Y,Breitling LP,Balavarca Y,et al.Comparison and combination of blood DNA methylation at smoking-associated genes and at lung cancer-related genes in prediction of lung cancer mortality[J].Int J Cancer，2016，139(11)：2482-2492.

[3]Singh DK,Bose S,Kumar S.Regulation of expression of microRNAs by DNA methylation in lung cancer[J].Biomarkers，2016，21(7)：589-599.

[4]吕志强,朱曦龄,郭晓东,等.Galectin-1在大肠癌细胞系中的表达及意义[J].中国临床保健杂志，2012，15（4）：394-396.

[5]刘华,米建强,于娟娟,等.Galectin-1与VEGF、CD105在宫颈癌组织中的表达及其临床意义[J].现代肿瘤医学，2012，20(12)：2606-2609.

[6]魏魁杰,潘红芽,杨筱,等.口腔鳞癌组织中Galectin-1表达及其临床意义[J].实用口腔医学杂志，2011，27(2)：217-221.

[7]van Beijnum JR,Thijssen VL,L ppchen T,et al.A key role for galectin-1 in sprouting angiogenesis revealed by novel rationally designed antibodies[J].Int J Cancer，2016，139(4)：824-835.

[8]Chen J,Tang D,Wang S,et al.High expressions of galectin-1 and VEGF are associated with poor prognosis in gastric cancer patients[J].Tumour Biol，2014，35(3)：2513-2519.

[9]潘洪飞,任大鹏,孟凡东,等.缺氧环境中Galectin-l对口腔鳞癌细胞增殖、侵袭与凋亡的影响[J].现代肿瘤医学，2014，22（9）：2006-2009.

[10]Noda Y,Kondo Y,Sakai M,et al.Galectin-1 is a useful marker for detecting neoplastic squamous cells in oral cytology smears[J].Hum Pathol，2016（52）：101-109.

[11]10 Satelli A,Rao US.Galectin-1 is silenced by promoter hypermethylation and its re-expression induces apoptosis in human colorectal cancer cells[J].Cancer Lett，2011，301 (1)：38-46.

[12]Salvatore P,Benvenuto G,Pero R,et al.Galectin-1 gene expression and methylation state in human T leukemia cell lines[J].Int J Oncol，2000，17(5)：1015-1018.

[13]Satelli A,Rao US.Galectin-1 is silenced by promoter hypermethylation and its re-expression induces apoptosis in human colorectal cancer cells[J].Cancer Lett，2011，301(1)：38-46.

Study of Methylation of Galectin-1 Gene in Patients with Acute Myeloid Leukemia

LUO Ya-yue1,YIN Zhao-sheng2,FU Xiang-jie2,ZHANG Wei2,LIU Juan2,TAN Tan2
1.The Outpatient Department,Chenzhou First People's Hospital Affiliated to University to South China,Chenzhou,Hunan Province, 413000 China；2.Center for Laboratory Medicine of Chenzhou First People's Hospital Affiliated to University of South China,Chenzhou Hunan Province,423000 China

Objective To detect acute myeloid leukemia (AML)methylation status of Galectin-1 gene,to investigate the expression and promoter methylation.Methods Our out-patient department,54 patients during January 2014 to December 2015 with AML before the treatment of bone marrow,bone marrow of 35 cases of the control and 8 cases of complete remission after treatment of AML bone marrow samples by methylation specific PCR (MS-PCR)to detect the methylation status of Galectin-1 gene.Results Galectin-1 gene expression levels in bone marrow in average AML was significantly lower than the control of bone marrow(0.35±0.09)VS(0.87±0.22)in complete remission,average expression level of AML in bone marrow was significantly higher than that before treatment of bone marrow(0.79±0.21)VS (0.33±0.11);Galectin-1 gene in bone marrow of methyl AML positive rate was significantly higher in the bone marrow(79.6%VS 17.1%),in complete remission in the bone marrow of methyl AML positive rate was significantly lower than before treatment(12.5%VS 75%);the expression level of Galectin-1 gene and its methylation negative correlation.Conclusion Galectin-1 gene in AML table Up to down or missing,and its promoter methylation related.

Acute Myeloid Leukemia；Galectin-1；Methylation

R733.71

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2016.02.02.01

2016-03-27；

2016-04-13

湖南省卫生厅科研计划项目（B2010-127）。

罗雅月（1982.10-），女，湖南郴州人，主治医师，在读研究生，研究方向：肿瘤学，白血病发病机制。

谭潭（1980.1-），男，湖南祁阳人，硕士，主管检验师，硕士生导师，研究方向：白血病发病机制，E-mail:tantan1413@126.com。