Poloxamer188复合米托蒽醌聚D，L-乳酸-co-乙醇酸电纺纤维的表征

王瑛颖，董欣，刘阳，黄佳娜，王浩

(1.锦州医科大学药学院，辽宁 锦州 121000；2.山东省医用高分子材料重点实验室，山东省药学科学院，山东 济南 370102)

电纺纤维作为药物释放载体应用近20年了，采用脂肪族聚酯作为成纤维材料被认为是比较理想的选择，但是脂肪族聚酯的有机溶液表面张力较大，较难形成形态理想的纤维。所以，人们尝试将表面活性剂共溶解在脂肪族聚酯的有机溶液中以降低体系的表面张力，以期顺利静电纺丝并得到形态较理想的复合纤维[1-2]。这其中，非离子型表面活性剂由于其低毒性、良好的共溶解性、对水不溶药物较高的增溶作用等，是一种较理想的选择[3]。被采用的非离子型表面活性剂已经有很多，这其中又以Poloxamer188最为理想，并得到了较多的研究。原因主要有4点：(1)Poloxamer188低溶血性、低毒性、可肾排泄，生物学性质良好，是现有的屈指可数的可以静脉注射的表面活性剂；(2)电纺纤维比表面积大，在制备过程中会较多的接触气体环境，Poloxamer188分子中主要为碳-碳单键和醚健，化学性质稳定，尤其是对空气中的氧气、二氧化碳、水蒸气稳定；(3)Poloxamer188对很多水不溶化合物的增溶，且增溶量很高；(4)Poloxamer188相对廉价、易得[4-5]。

现有的关于Poloxamer188复合脂肪族聚酯电纺纤维中的成纤维材料主要集中在聚L-乳酸，对于聚D-乳酸-co-L-乳酸共聚物、聚乳酸-co-乙醇酸共聚物、聚ε-己内酯等研究较少。本论文采用聚D，L-乳酸-co-乙醇酸(poly D，L-lactic acid-co-glycolic acid，PLGA)作为纤维形成的基质材料，Poloxamer188为复合表面活性剂，将模型药物米托蒽醌(Mitoxantrone)通过与前两者共溶液-静电纺丝的方法载入该纤维中。考察所得纤维的形态、载药、释药行为。将米托蒽醌载入电纺纤维亦有一定的药剂学意义。该药是治疗乳腺癌的首选药物，对某些其他肿瘤也有较好的疗效。局部给药剂型：如水凝胶、大粒径脂质体、电纺纤维等，可能会提高其治疗指数[6-8]。作为植入型药物新剂型进行研究和使用也一直是通过静电纺丝制备所得微纳米级纤维膜、毡、支架等材料的主要应用方向[9-10]。

1 材料与方法

高压静电发生器(东文高压电源厂，中国，天津)；台式扫描电子显微镜(TM3000，Hitachi公司，日本)；高效液相色谱仪(ELITE LaChrom，Shimadzu公司，日本)；PHS-2F精密酸度计(精科仪器，中国，上海)。

米托蒽醌原料药(含量98.9%，美仑生物技术有限公司，中国，大连)；n-十二醇引发开环聚合并单封端的聚D，L-乳酸-co-乙醇酸(PLGA，由本课题组合成[11]，第1种是摩尔比为乳酸∶乙醇酸=70∶30，D-乳酸∶L-乳酸=50∶50，Mw=15.6万，多分散系数PDI=1.36；第2种是摩尔比为乳酸∶乙醇酸=50∶50，D-乳酸∶L-乳酸=50∶50，Mw=14.9万，多分散系数PDI=1.41)；Poloxamer188(德国Basf原产进口分装，美仑生物技术有限公司，中国，大连)；二氯甲烷(分析纯，天力化学试剂公司，中国，天津)；乙酸(分析纯，天力化学试剂公司，中国，天津)；乙腈(色谱纯，光复精细化工，中国，天津)；去离子水(娃哈哈集团，中国，杭州)。

2 方 法

2.1 静电纺丝与材料表征

首先，配制材料全部溶解、体系均一无分层、3日内稳定的纺丝溶液以待静电纺丝。其中PLGA的量每组均设为1 g，不同样品中Poloxamer188的量不同，以考察Poloxamer188复合量对纤维形态及药物释放的影响。实验采用均相溶液纺丝法，要求各物质均要溶解在溶剂中。为了使得米托蒽醌能够完全溶解在PLGA-Poloxamer188-二氯甲烷共溶液中，本实验在该体系中又加入了0.5 mL乙酸。本文试验了两种PLGA，第1种是摩尔比为乳酸∶乙醇酸=70∶30的；第2种是摩尔比=乳酸∶乙醇酸为50∶50的，发现在含有米托蒽醌、Poloxamer188和PLGA 3种固体物质的二氯甲烷-乙酸的混合溶剂体系中，采用第1种PLGA时能够形成所有固态物质完全溶解、无沉淀的共溶液体系，且该体系呈深蓝色；但是采用第2种PLGA时，体系中的PLGA不能完全溶解。所以，本文提及的实验结果均为乙醇酸(摩尔比)为70∶30的PLGA。为了考察纤维中米托蒽醌的载量和Poloxamer188的复合量对纤维形态和药物释放经时百分率的影响，设置了10%、20%、30% 3种Poloxamer188复合量和15%、30%、45% 3种米托蒽醌载量。所得纤维的命名见表1。

表1 各电纺纤维中Poloxamer188和米托蒽醌对聚D，L-乳酸-co-乙醇酸的质量比率(%)

各种材料加入溶剂后磁力搅拌72 h，得到深蓝色、透明且无不溶物的粘稠溶液。纺丝装置参考文献搭建完毕后按如下条件静电纺丝：纺丝电压为12 000 V，供液速度为(2.0±0.25) mL/h，纺丝距离(针头与锡箔平面之间的距离)为25 cm，空气温度为(20±2)℃，空气相对湿度为(50±2)%。电压加载后发现一些溶液从针头口流出的纺丝液在电场力的作用下能够顺利形成Taylor锥，一些则不能够。形成的Taylor锥以螺旋轨迹向接收平板运行并沉积。纺丝完毕后，接收平板上形成一张由纤维层积而成约(1.1±0.2)mm厚的无纺纤维薄毡。揭下该毡后，(35±2)℃下真空除溶剂72 h，按一定规格用剪刀切成小片后进行表征、药物释放等研究[12]。

外观上所制得的电纺纤维为深蓝色纤维毡，将其剪切成0.5 cm×0.5 cm小片后用导电胶固定在金属砧上并用金真空蒸镀，之后用扫描电子显微镜进行电纺纤维微观形貌的观察。

X-射线衍射分析方法：称量约1 g的电纺产品均匀铺于玻璃片的凹槽内并置于广角X-射线衍射仪室温下测试，扫描范围：5°～60°，扫描速率：8o/min。

差示热分析方法：称量约25 mg电纺产品，置入合金金属样品盒内压封，置于差示热分析仪，氮气流保护下温度从25 ℃升至400 ℃，升温速率：5 ℃/min。

2.2 药物释放

采用高效液相色谱-紫外分光光度法测定释放介质中米托蒽醌的含量。色谱条件：色谱柱Elite®C18柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流动相为乙腈-庚烷磺酸钠溶液(v/v=33/67)；检测波长为244 nm；流速为1 mL/min；柱温为25 ℃；进样量为20 μL。庚烷磺酸钠溶液的配制为：取4.4 g庚烷磺酸钠溶于200 mL纯水中，加6.4 mL冰醋酸，用水稀释至730 mL[13]。

将样品剪切成约5 cm×5 cm正方形条，使得每片的质量约为100 mg，浸入30 mL磷酸缓冲盐释放介质中(磷酸缓冲盐的配制为：取磷酸二氢钾0.68 g，加0.1 mol/L氢氧化钠15.2 mL，用水稀释至95 mL后用磷酸调pH为6.4，最终定容至100 mL)。置于恒温空气浴摇床中，在37 ℃、100 r/min条件下振摇释放。在设定的时间点取出全部释放介质后按照前述方法进行米托蒽醌含量的测定。之后在释放介质中重新添加30 mL新的释放介质。绘制绝对释放量和相对释放百分率对时间的曲线[14]。

3 结果与讨论

3.1 纤维形态

所有所得纤维外观均为深蓝色纤维毡，蓝色的原因显然是药物本身的颜色所导致的。图1为电子显微镜下观察所得纤维的微观形态。发现F-10%-15%、F-10%-30%、F-10%-45%、F-20%-15%、F-20%-30%、F-30%-15%能顺利纺丝并形成纤维，其他情形不能顺利纺丝形成纤维。这其中，形态较为理想的纤维是F-10%-30%和F-10%-45%，表现为无珠子结构出现且纤维直径较为均一。F-10%-15%有很多珠子结构出现，F-20%-15%、F-20%-30%、F-30%-15%纤维直径不均一且黏连较为严重，有零星珠子结构出现。无论纤维形态理想与否，在纤维表面均无材料分相和结晶析出现象，提示材料的复合与药物的包裹可能较为理想，但是具体情况和药物的释放行为还需要进一步表征。

在本研究中，待纺溶液中含有米托蒽醌、PLGA、Poloxamer188、二氯甲烷、乙酸等5种物质，又由于各种物质之间相互复杂作用，所以该体系是一个十分复杂的体系。实验中亦考察了其他Poloxamer188复合量和米托蒽醌载量的情形，但是发现当Poloxamer188复合量较高时(>30%)，药物突释十分明显，故本文仅考察10%、20%和30%的Poloxamer188复合量的情形并以此为例探讨Poloxamer188复合量对纤维形态及药物释放的影响。同时也发现药物的复合量对待纺液的可纺性和纤维形态亦有明显影响。另外，当Poloxamer188和米托蒽醌的载量发生变动时，体系会出现不能纺丝、固体物质溶解不完全，颜色过深不能观察溶解状态等情况。这些现象的原因暂时未能明晰，有待以后继续深入研究。

3.2 药物释放与材料复合

图2A为系列样品中米托蒽醌的绝对释放量，经过折算得到经时绝对释放量相对于各样品载药量的百分释放量如图2B所示。可知纤维中Poloxamer188复合量与米托蒽醌载药量对药物本身的释放行为均有影响，两者在纤维中载量的升高均会导致米托蒽醌突释量和平台期释放量的升高。当Poloxamer188复合量从10%增加至20%和30%时，载药量10%的纤维的百分释放量从30.5%增至49.3%和71.0%。当Poloxamer188复合量从10%增加至20%时，载药量20%的纤维的百分释放量从49.3%增至65.3%。当Poloxamer188复合量不变(15%)，米托蒽醌的量从10%增加到20%和30%时，其百分释放量从30.5%增加至49.3%和71.0%。

F-10%-15%F-10%-30%F-10%-45%

F-10%-15%#F-10%-30%#F-10%-45%#

F-20%-15%F-20%-30%F-30%-15%

A代表绝对释放量；B代表相对百分释放量；C代表相对百分释放量前24 h局部

米托蒽醌载药量与Poloxamer188复合量对释放曲线的形状没有明显的影响。所有被考察的电纺产品均由突释相和平台相组成，缓释相比以往相关研究的小很多。所考察样品的突释量(15 min时的百分释放量)均小于30%，但是随之在12 h之内释药量迅速上升，并且缓释期除了F-10%-45%外均小于12 h，即12 h后几乎再无明显的释放增量(12 h后的释放量<24 h前的10%)，释放曲线已经达到平台相，如图2(C)所示。在42 d(1008 h)后，各个纤维中仍然有较多未释放的药物。

A从下至上分别代表米托蒽醌、 Poloxamer188、PLGA、F-10%-15%、F-10%-30%、F-10%-45%、F-20%-15%、F-20%-30%、F-30%-15%

由图3的X-射线衍射图谱可知，米托蒽醌在5°～30°之间呈现较多的特征峰，Poloxamer188在19.16°和23.32°处有2个明显的特征峰，PLGA在量程范围内无特征峰，只有在10°～30°范围内衍射强度较其他2θ处大，形成一个“馒头峰”。5种载药纤维中任何一种载药纤维的衍射图谱上均无衍射强度较大即明显的特征峰，但是F-10%-15%，F-10%-30%和F-20%-15%在“馒头峰”上有若干衍射强度较小的峰，且在低角度处亦有特征峰出现。但这些峰未能归属，可能是材料复合和载药过程中出现的结晶特征，其可能由纤维中的一种物质引起，亦可能是纤维中几种物质复合后所导致的现象。总的来说，静电纺丝后具有明显特征峰的米托蒽醌和Poloxamer188的特征峰均无展现，说明两者在纤维表面分散良好，这是药物释放的前提。

A从下至上分别代表米托蒽醌、Poloxamer188、PLGA、F-10%-15%、F-10%-30%、F-10%-45%、F-20%-15%、F-20%-30%、F-30%-15%

图4为纤维中3种原料和系列载药电纺纤维样品的差示热分析曲线，发现米托蒽醌和 Poloxamer188 均对电纺纤维的热分析曲线有明显影响。热分析曲线展现了米托蒽醌的两个尖锐的吸热峰，在76.4 ℃和175.9 ℃；Poloxamer188有一个较宽的放热峰，谷值在227.9 ℃和274.6 ℃，且该峰较为宽泛，跨度从150 ℃～300 ℃；PLGA原料的分解峰较大，峰值在353.7 ℃。静电纺丝后，米托蒽醌的峰未明显出现，说明该药物较好复合在电纺纤维中，佐证了X-射线衍射的结果。另一方面，载药电纺纤维的在较高温度时曲线上呈现较多变化，体现在均有放热峰的存在，这可能是Poloxamer188的复合引起的。但是放热峰的大小很不同，对于F-10%-15%、F-10%-30%和 F-10%-45%，其放热峰相比F-20%-15%、F-20%-15%和F-30%-15%小；F-10%-15%和F-10%-30%的峰谷位均在300 ℃以下，与Poloxamer188原料的峰谷位较为相近。F-30%-15%、F-20%-15%和F-20%-15%的峰谷位在300 ℃～350 ℃之间，远离Poloxamer188原料的峰谷位。这说明，Poloxamer188复合量的升高导致了复合效应的增大，而复合效应增大有可能导致药物释放量的增高，这佐证了药物释放量的结果。F-10%-15%、F-10%-30%和 F-10%-45% 3者中，随着载药量的增高，峰谷位逐渐向高温移动，亦说明复合效应的增强，亦会导致药物释放量的增高，药物释放量的结果同样解释了这一点。

一般地，X-射线衍射的结果只能够说明纤维表面材料复合的状态，但纤维内部材料复合情况需要差示热分析等手段进行表征，综合本实验中X-射线衍射和差示热分析的结果可以得知，对于F-10%-15%、F-10%-30%和F-10%-15%，纤维表面有些许小峰提示了表面复合的不完全，且前两者纤维内部的复合亦不如其他纤维。可见两种表征结果互为佐证。

根据药物释放的结果和X-射线衍射、差示热分析的表征结果，以及相似研究内容文献中的信息，可以得出以下3点结论：(1)虽然米托蒽醌在15 min后的释放量不是很大，但是在12 h内便会达到最大释放量，12 h内的释放量可以认为是该系列纤维的突释量，这提示了相当比例的药物存在于纤维表面或近纤维表面的部位，但是以形成无定型复合物状态存在；(2)Poloxamer188复合量的升高、米托蒽醌的载量升高均有助于药物本身的释放，可能原因为两者载量较多时均能够形成致孔效应，材料间的良好复合是药物能够较大量释放的前提；(3)平台期后仍然有相当比例的米托蒽醌没有被释放及其释放曲线在较短的时间内即达到平台期等现象说明有相当部分的米托蒽醌在纤维中与PLGA结合紧密，难以在纤维基质内部移动，这可能是由于米托蒽醌中蒽醌上的羟基和侧链上的胺基等与PLGA发生氢键作用进而紧密结合所导致的[14-16]1-5，这需要进一步的研究。

3 结 论

本实验采用均相溶液纺丝法制备载有米托蒽醌的Poloxamer188复合PLGA电纺纤维，并在纺丝液中添加乙酸使米托蒽醌充分溶解。发现当米托蒽醌的载量在10%Poloxamer188复合量在30%和45%时能够得到形态较为理想的纤维。当米托蒽醌的载量在30%Poloxamer188复合量在15%时药物的百分释放量最高。本研究提供了聚D，L-乳酸-co-乙醇酸(摩尔比乳酸∶乙醇酸=70∶30，D-乳酸∶L-乳酸=50∶50)电纺纤维中Poloxamer188及米托蒽醌载量对纤维形态及释药行为影响的初步信息。