不同剂量射线对非小细胞肺癌患者mTOR信号通路的影响

肖旭阳，杜天宇，周玄，王立坤

(锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000)

肺癌是临床上常见的一种原发性恶性肿瘤，起源于气管、支气管粘膜或腺体，根据组织病理学特点不同，可分为非小细胞肺癌与小细胞癌，其中非小细胞肺癌最为常见，占总发病率的85%以上，不具有传染性，但遗传性、家族聚集性较强，处于临床I期的患者其5年生存率仅有60%～70%，发病率、死亡率较高，在女性人群中，死亡率位列第二，是全球癌症死亡的主要原因之一，早期症状不明显，进一步的会发生恶化与转移，等确诊时，大多数患者已处于疾病晚期，治疗难度较大，给患者的生命健康造成了极大的威胁[1-2]。临床上常用手术的方法治疗非小细胞肺癌，可一定程度控制病情发展，但由于疾病晚期患者，免疫力降低，身体自我保护机制搜到损害，削弱了手术整体效果，而放射治疗联合化学治疗成为了治疗非小细胞肺癌的有效方法[3-4]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在肺癌细胞的增殖、疾病的发展中起着重要作用，激活mTOR信号通路，可加快细胞的新陈代谢，与癌症进展有着密切关系[5-6]。现阶段单一利用雷帕霉素激活mTOR信号通路方法并不成熟，正处于研究阶段，雷帕霉素类药物有希望成为治疗非小细胞肺癌的首选药物。本研究探讨不同剂量射线作用对非小细胞肺癌患者mTOR信号通路的影响，具体报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

所用培养液为：RPMI1640，试剂有：谷氨酰胺、氨苄青霉素钠、硫酸链霉素、雷帕霉素，胎牛血清，mTOR、p70S6K、p-4EBPI、β-actin，免疫组织化学SP试剂盒、二氧基联苯胺(DBA)显色剂，24孔板、96孔板、细菌培养皿，FACSCalibur流式细胞检测仪、Annexin V-FITC凋亡试剂盒、ECL发光试剂盒，X射线感光胶片、定影液、显影液。其中，ELC发光试剂盒购自Millipore，X射线感光胶片、定影液和显影液均购自碧云天生物技术研究所。

1.2 细胞培养

人非小细胞肺癌系A549购自ATCC(VA，USA)，使用含10%胎牛清的RPMI1640细胞培养液，在无菌条件下进行培养，温度设置为37 ℃，细胞融合度为80%时，将经胰蛋白酶消化过的细胞收集起来[7-8]。

1.3 电离辐射

进行细胞种植，融合度≥60时，清洗培养液，利用Varian-23Ex-1、X-Ray generator进行细胞照射，照射方式为：直线加速器照射(M9-XHA600C)，照射野是10 cm×10 cm，X射线能量：6 MV，剂量分别为2、4、6、8 Gy。

1.4 Wastern Blot检测

提取细胞总蛋白，经过电泳、转移后，加入100 mL/L脱脂奶粉，密封1 h，加入1∶200稀释过的一抗，温度保持恒温4 ℃下过夜，加入1∶5000稀释过的HRP-IgG，室温孵育60 min，通过化学发光试剂曝光显影，扫描胶片[9-10]。

1.5 细胞活力检测(MTT)

进行细胞活力检测(MTT)，在96孔板中接种细胞，时间为1 w，1 w后才有0.4%台盼蓝染液进行染色，溶解，使用分光光度计进行吸光度检测，利用电脑绘制图谱[11-12]。

1.6 细胞凋亡检测

将细胞接种于6孔板中，进行贴壁处理，加入不同浓度的matrine，在不同的时间短观察细胞生长情况，观察时间段为24、48、72 h，然后制作细胞悬液，检测细胞活性，重复进行3次，减少误差。

1.7 克隆形成试验

将1×103的非小细胞肺癌A549细胞接种到含有雷帕霉素的培养基中，进行细胞培养，规定不同剂量射线照射的时间、天数，用甲醇固定细胞，使用吉姆萨染色，统计克隆数量，设置3个复孔，重复3次。

1.8 统计学方法

2 结 果

2.1 雷帕霉素药物对mTOR信号通路及下游信号分子的抑制作用

随着雷帕霉素药物浓度升高，mTOR、p70S6K、p-4EBPI及AKT表达降低，β-actin作为内参，见图1。

图1 雷帕霉素药物对mTOR信号通路及下游信号分子的抑制作用

2.2 雷帕霉素对非小细胞肺癌放疗敏感性的影响

观察组细胞存活能力低于对照组(P<0.05)，见图2。

系列1代表A549，系列2代表A549+雷帕霉素，系列3代表(A549+雷帕霉素)+4 Gy，系列4代表(A549+雷帕霉素)+8 Gy

2.3 雷帕霉素作用下非小细胞肺癌放疗对细胞克隆形成能力的抑制作用

将非小细胞肺癌细胞系A549接种于培养皿中(直径：100 mm)，观察组用含50 nmol/L的雷帕霉素培养基，对照组常规培养。细胞分别用剂量为4 Gy、8 Gy的射线照射2 w后，甲醇固定，吉姆萨染色照相，发现4 Gy观察组细胞平均克隆数目为(56±4)，8 Gy观察组细胞平均克隆数目为(18±3)，低于对照组(146±23)(P<0.05)。

3 讨 论

非小细胞肺癌作为常见的恶性肿瘤之一，多发于老年人群，近年来随着生活方式的改变，发病人群逐渐年轻化，根据病理类型可分为腺癌、鳞癌、大细胞癌、腺鳞癌、唾液腺型肿瘤等，发病率、死亡率越来越高，细胞分化发生异常、增殖不受控制，是肺癌细胞区别于正常细胞的最显著的两个特征，目前常用放疗或化疗的方法进行治疗[13-14]。近年来，mTOR通路在肺癌治疗中受到了广泛关注，当PI3K收到受体酪氨酸激酶、Ras、整合素以及各种生长因子等多种因子，被激活时，可加快磷酸化肌醇诱导3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇及3，4-二磷酸磷脂酰肌醇的生成，被激活的Akt，通过3-磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶1及3-磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶2磷酸化，将信号传递给mTOR，进而两种复合形态的mTOR，对下游的mRNA进行转录调节，影响细胞的新陈代谢速度。另外在肿瘤细胞中，AKT可通过磷脂酰肌醇3-激酶磷酸化激活caspase9、Bad、FOXO、GSK-3b及IKK等因子促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。同时，pAKT还可以缓解TSC1/2和Rheb对mTOR的抑制，而激活的mTOR与RAPTOR结合后可以通过mTORC1磷酸化激活核糖体S6激酶，干预5’-TOP结构对mRNA的翻译，影响细胞生长。有研究表明，mTOR信号通路与肺癌细胞的增殖关系密切，可从多种方面加快细胞癌变，激活mTOR信号通路，会加快细胞的凋亡，且机体内mTOR蛋白水平与肺癌化疗效果呈正相关，抑制该通道，逆转耐药性，提高化疗、放疗的效果[15-16]。但目前关于mTOR信号通路对非小细胞肺癌放疗的敏感性报道较少，本研究在此基础上展开了研究。

本研究中，观察组非小细胞肺癌细胞存活能力低于对照组(P<0.05)，说明mTOR信号通路对非小细胞肺癌放疗效果较好。mTOR信号通路被激活后，可将磷酸化下游靶蛋白p70S6k和p-4EBPI转移，加快细胞增殖，而通过雷帕霉素对非小细胞肺癌细胞的抑制作用，降低mTOR蛋白、p70S6k和p-4EBPI的表达能力，构建mTOR信号通路抑制非小细胞肺癌细胞[17-18]。细胞凋亡是基因程序化、生命力顽强的细胞自杀的一个过程，可调节机体内的细胞平衡，清除多余的细胞，促进细胞新陈代谢，而细胞在死亡过程中发生异常，会减少细胞的增殖，加快细胞死亡速度，成了治疗非小细胞肺癌的重要方法之一。自噬可加快细胞死亡速度，不同剂量射线作用可诱导肺癌细胞死亡，mTOR通路诱导肺癌细胞自噬和凋亡，抑制细胞增殖，从而起到抑制肿瘤的作用。而血管内皮生长因子可选择性与血管内皮细胞膜上高亲和力的受体硌氨酸激酶结合，造成受体磷酸化，从而发生活化，加快内皮细胞迁移，mTOR基因表达水平作为Akt的下游信号，受血管内皮生长因子影响，可提高诊断灵敏度[19-20]。另外mTOR由mTORC1和mTORC2两种多蛋白复合体组成，mTORC1对雷帕霉素敏感度较高，mTORC2对雷帕霉素耐受性较强，mTORC1可调节细胞基因转录、蛋白质合成及细胞增殖，当mTOR失调后，将导致癌症等诸多疾病发生，而活化后的mTORC1可诱导核糖体S6激酶、真核翻译启动因子4E，mTORC2参与细胞骨架调节，控制细胞的生长、代谢[21]。另外肺癌细胞在增殖状态，会产生一些放射耐受细胞，可通过多种细胞因子、激素及生长因子进行信号转导，改变信号通路，使机体对放疗产生抗拒，而哺乳动物雷帕霉素靶蛋白是AKT信号通路下游的效应分子，可促进细胞周期素的表达，发挥AKT的抑制作用，提高对射线的敏感性，从而提高放疗敏感性。

综上所述，mTOR信号通路被抑制后，可促进细胞凋亡速度，加快细胞新陈代谢能力，提高放疗效果，增强非小细胞肺癌放疗敏感性。