供肾零点穿刺组织Klotho蛋白表达与病理结果相关性分析

高云龙，马健波，张睿，武伦，魏涧，高嘉良，苟志敏，刘一魁

(1.锦州医科大学国药东风总医院研究生培养基地；2.湖北医药学院附属国药东风总医院，湖北 十堰 442000)

肾移植是治疗终末期肾脏病最有效的治疗手段，也是改善患者生活质量最好的方法。目前由于供体肾脏资源的紧缺，为了供肾与患者更好的匹配，减少排斥反应，延长肾脏使用年限，供体肾脏需要穿刺活检对其质量进行评估。最近文献报道Klotho蛋白的异常表达与慢性肾脏病[1-3]、急性肾损伤[4]以及缺血在灌注损伤[5-6]有关。Klotho蛋白是由klotho基因编码的一种单向跨膜蛋白，主要在肾小管上皮细胞中表达，相关研究也证实了Klotho蛋白确实与肾上皮细胞衰老有关[7]，并且发现Klotho蛋白有部分肾脏的功能，如调节1，25(OH)2D3、磷酸盐[8-9]。然而关于Klotho蛋白在移植肾脏中的研究较少。因此，我们研究Klotho蛋白在供肾零点穿刺组织中的作用，旨在探讨Klotho蛋白表达情况与供肾零点穿刺病理结果之间的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2019年1月至2020年8月期间，我院DCD供肾零点穿刺活检的石蜡标本及病理报告，共42例(左右肾脏)，其中未在本院行手术9例，蜡块标本组织在切片时未见组织1例，其余32例，其中男20例，女12例，平均(56.44±6.90)岁。本研究得到医院伦理委员会批准(LW-2021-002)。

1.2 入选标准

(1)符合器官捐赠标准；(2)术后受者未发生超级性排斥反应及急性排斥反应；(3)无移植肾功能延迟恢复。

1.3 排除标准

(1)供者有明显的心、肝功能不全；(2)供者病例资料不全者；(3)合并传染性疾病者。

1.4 分组

根据术前病理科对供肾零点穿刺组织病理结果Remuzzi分级评分，将32例按照总评分的平均值分为高分组(8.13±1.50)和低分组(3.81±1.11)。

1.5 检测指标

检测32例供肾零点穿刺组织不同Remuzzi病理分级评分石蜡切片中Klotho蛋白表达情况。

1.6 检测方法(免疫组织化学手工染色法)

制片：将收集的石蜡放入冰箱中冷冻片刻，取出后进行切片处理，厚度约为4 μm，70 ℃烤片2 h。

脱蜡：将玻片分2次浸泡在二甲苯溶液中(5分钟/次)，再浸泡在无水乙醇中5 min，然后依次用无水乙醇、95%、75%浓度的酒精快速洗涤，清水冲洗2～3次后吹干。

水化：将载玻片置于摇摆床用PBS液洗3次(3分钟/次)。

抗原修复：采用高压锅加热柠檬酸溶液，其操作步骤为：将玻片置于其中，开火待煮沸后计时150 s后，关火冷却15 min，再将玻片置于PBS溶液中(方法同前)。

封闭：为封闭内源性过氧化物酶及蛋白质，将玻片置于3%过氧化氢溶液中浸泡10 min后，继续用PBS液洗片。

滴加一抗(40 μL，Anti-Klotho抗体，abcam，美国)：根据组织大小滴加适量稀释比为1∶300的一抗，并恒温维持在4 ℃孵育过夜；复温1 h后PBS溶液洗3次(方法同前)。

滴定二抗(50 μL，由武汉安捷特生物技术有限公司进口分装，武汉市洪山区街道口京韵花园B-2601)检测试剂：取适量稀释比为1∶300的二抗滴于玻片，轻轻晃动后，孵育30 min，再次洗片3次。

DAB显色(DAB显色试剂盒，3 mL，北京中杉生物技术有限公司)：配制DAB显色工作液(浓缩DAB溶液50 μm与DAB底物液1000 μm)必须即配即用，显色8 min。

生态学是一门综合性、实践性很强的学科。室内实验与野外调查相结合是生态学教学中一项十分重要的教学活动，是检验理论知识掌握得牢固与否的主要手段。

脱水：将胶片分别在浓度为75%的酒精、95%的酒精、无水乙醇中快速洗涤，然后依次在无水乙醇和二甲苯中浸泡5 min，换二甲苯再次浸泡5 min后，将胶片吹干、封片、阅片。

1.7 研究方法

供肾零点穿刺病理结果根据Remuzzi病理分级评分，据肾小球硬化比例、肾间质纤维化、肾小管萎缩、肾间质炎症、小动脉内膜纤维化增厚、动脉透明样变、肾小球内微血栓、肾小管损伤、坏死病理学表现，若无上述情况计为0分；轻度1分；中度2分；重度3分[10]，评分结果见表1，HE染色病理结果见图1。肾脏各自的评分据32例总评分的平均值分为两组，每组各16例；将收集到的32例石蜡组织制备的标本玻片由病理科资深医生随机选取3个清晰视眼采图，利用Fiji-ImageJ软件计算采集图片的阳性面积所占百分比，取其平均值进行分析计算，并使用Graphpad Prism 8软件完成箱线图，分析两组之间Klotho蛋白表达有无统计学差异。

表1 供肾活检组织病理学表现评分表

Aa供肾零点穿刺病理结果未见肾小球硬化，未见肾小球系膜细胞及基质增生，血管内未见管壁玻璃样变及内膜增厚，间质未见纤维组织增生，可见个别炎症细胞浸润，与b来源于同一肾脏组织。a、b、c为HE 100×，d为HE 200×

1.8 统计学方法

2 结 果

2.1 Remuzzi病理分级评分分组结果

根据供肾零点穿刺病理结果病理学表现评分按总的平均值分为两组，每组16例，总平均值为5.97。高分组(8.13±1.50)，其中男7例，女9例；低分组(3.81±1.11)，其中男13例，女3例。

2.2 Klotho蛋白在组织中的表达情况

按照Remuzzi分级评分高低分两组，检测Klotho蛋白表达情况，分析两组之间Klotho蛋白表达差异有无统计学意义。我们的研究结果如下：Remuzzi分级评分高分组(21.61%±8.24%)，Remuzzi分级评分低分组(49.90%±9.71%)，两组之间Klotho蛋白表达也有统计学差异(F=0.36，P<0.001)，见图2～4。

左100×，右400×

左：100×，右：400×

图4 Remuzzi病理评分两组之间Klotho蛋白表达情况

2.3 组织Klotho蛋白表达与年龄相关关系

统计32例肾脏组织Klotho蛋白表达平均水平(35.76%±16.88%)，供肾零点穿刺组织中Klotho蛋白表达与供肾年龄没有发现线性相关关系，见图5。

2.4 组织Klotho蛋白表达与Remuzzi病理结果评分相关关系

发现供肾零点穿刺组织中Klotho蛋白表达(%)与其对应病理结果高度相关，有统计学意义(r=-0.834，P<0.001)，见图6。

r=-0.033，P<0.859

3 讨 论

本报告是对32例我院DCD供肾零点穿刺组织病理Remuzzi病理结果评分与其对应组织中Klotho蛋白表达情况之间关系的研究。其人群特点：其中男20例，女12例，平均(56.44±6.90)岁，获取前的评估均符合肾脏器官捐赠标准，供肾者既往史没有高血压、糖尿病、肾炎及严重传染病史，在移植术后均未出现急性排斥反应及移植肾失功。

肾移植手术能够给尿毒症患者带来最大的受益，但对供肾质量的评估，目前仍缺乏一个统一的标准，零点穿刺病理检查是评估供肾质量的一种重要方法，其优势主要体现在供肾组织形态学改变上。近期大量研究发现Klotho在基因及蛋白表达分子层面对肾脏有一定保护作用[11-12]，这可能与Klotho蛋白能够降低炎症因子、抑制氧化应激介质的产生[13-14]、抑制纤维化[15]有关。

我们通过对供肾零点穿刺组织HE染色，Remuzzi病理结果评分进行分组，并对相对应的各组中零点穿刺组织进行免疫组织化学染色测定石蜡标本中Klotho蛋白的表达。在手术前病理科对供肾零点穿刺病理结果根据Remuzzi分级评分分为两组，发现两组分别对应Klotho蛋白阳性表达面积百分比之间的差异也有统计学意义(P<0.001)见图4；与此同时我们进一步通过线性回归方法分析了32例Remuzzi分级评分与对应供肾零点穿刺组织中Klotho蛋白表达阳性面积百分比之间的关系，发现供肾零点穿刺组织中Klotho蛋白的表达与其Remuzzi分级评分之间有高度相关性(r=-0.834，P<0.001)，图1与图2来源于同一组织。之前有研究报道[16]显示Klotho蛋白表达与年龄有一定的关系，因此我们也分析了供肾零点穿刺组织中Klotho蛋白的表达与年龄之间的关系，发现供肾零点穿刺组织中Klotho蛋白的表达与年龄之间没有发现相关性(r=-0.033，P=0.859)，这一结果与上述报道结果不一致，可能源于个体之间的差异或者标本不同、样本量有关。

观察免疫组织化学染色病理结果发现Klotho蛋白表达主要分布于细胞膜及胞浆内，尤其是多见于Remuzzi分级评分低分组，然而我们知道Klotho蛋白表达主要表达在细胞膜上，因此我们猜测胞浆的阳性表达与细胞膜分泌有关，这一结果在之前报道已经得到证实[17]，他们研究发现Klotho蛋白有自分泌与旁分泌功能。这一观点与我们研究结果是一致的，认为胞浆内可见褐色染色来源于细胞膜的表达。

综上所述，Klotho蛋白在供肾零点穿刺组织不同病理结果中的表达有医学统计学差异。目前零点穿刺病理检查是评估供肾质量的一种重要手段，能够客观地对组织形态改变进行评价，而肾脏组织Klotho蛋白研究主要在分子水平。因此，两者结合可以对肾脏组织形态学及分子水平综合评价，对供肾质量更全面地了解，能更准确地评估供肾功能水平。当然由于我院肾脏移植手术数量有限、纳入本研究的病例样本例数相对较少，供肾零点穿刺组织较小，其结论仍然需要多中心联合、扩大样本量验证，并且对供受者血液中Klotho蛋白的检测有待进一步研究，以便为术后肾功能检测提供一定理论依据，为临床医生提供肾移植术后潜在治疗靶点。