GDF-15对糖尿病小鼠肝损伤保护作用的实验研究

张泓娇，王小梅，王雅光，田鹤,穆长征

(1.锦州医科大学组织学与胚胎学教研室；2.锦州医科大学附属第一医院；3.锦州医科大学研究生学院，辽宁 锦州 121000)

糖尿病严重危害着人们的健康，其中2型糖尿病(type 2 diabete，T2DM)患者居多[1]。肝损伤是糖尿病并发症之一[2]。T2DM患者由于高血糖症出现，导致蛋白功能丧失，进而使肝脏氧化损伤。转氨酶升高是肝脏损伤的判断指标之一，肝脏中最常见的转氨酶是丙氨酸转移酶(alanine transferase，ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)；已糖激酶(hexokinase，HK)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)是调控糖酵解的酶，糖酵解是维持血糖稳定的重要因素，HK、PK升高会导致血糖升高，血糖升高会使炎症标志物升高，最终使活性氧(ROS)升高。丙二醛(malondialdehyde，MDA)作为氧化物的代表，可损伤肝细胞膜以及线粒体膜，从而损伤肝细胞。肝细胞损伤后，有大量的细胞因子产生，如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白细胞介素(interleukin，IL)等。

生长分化因子-15[3](growth differentiation factor-15，GDF-15)是一种氧化应激蛋白。在正常状况下，GDF-15大量表达在胎盘及前列腺等少数的组织。在肿瘤、炎症、心血管疾病以及外伤等各种应激状态下，GDF-15会大量表达[4]。目前，有实验证明它是肝脏损伤的新型标志物，并且通过免疫抑制、抗凋亡、抗炎和促进氧化代谢等方面对肝脏起到保护作用[5]。临床研究报道血清中GDF-15水平可作为一个有效的生物标志物，用于评估肝脏纤维化和慢性肝病的严重程度[6]。本文将通过炎症因子的检测等方法进一步探讨GDF-15可能对糖尿病诱导的肝损伤的保护作用。

1 资料与方法

1.1 模型建立及分组

C57BL/6J雄性小鼠(4～8周龄)60只(锦州医科大学实验动物中心提供)，体重18～22 g，适应性饲养1 w，随机选取10只作为正常对照组，其余50只小鼠高脂饮食喂养2 w，腹腔注射STZ按(40 mg/kg体重)，每天监测血糖，当小鼠空腹血糖达到(≥12 mmol/L)时，为造模成功[7]。按体重选取状态较好的小鼠30只随机分为3组，继续高脂饮食喂养30 d，具体分组及处理方法，见表1。

表1 动物分组及处理因素

1.2 取材及标本制备

小鼠眼眶取血，EP管收集血液，4 ℃冰箱静止2 h，低温离心取上清，-80 ℃冰箱保存备用。取血后小鼠灌流，立即取出肝组织，一部分称重-80 ℃冰箱保存备用；另一部分修剪成1 cm3小块，多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，用于HE和免疫组织化学染色。

1.3 血糖和体重监测

每天监测小鼠空腹血糖和体重并做记录，取体重和血糖变化最大的几天(第1、3、7、14、30天)作为血糖和体重变化依据。

1.4 血清中ALT和AST含量的测定

取-80 ℃冰箱保存备用的血清，按照试剂盒说明书进行ALT和AST水平的测定。

1.5 肝组织中TG、TC、SOD、MDA、HK及PK的测定

取各组小鼠冻存的肝组织40 mg，按肝组织重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入360 mL的生理盐水，制成匀浆，4 ℃离心10 min，取上清即为10%的肝匀浆液，将其分成两份，一份用于检测TG、TC、SOD、MDA值；另一份用生理盐水1∶9比例稀释成1%肝组织匀浆液，测定HK、PK酶的活力，卡马斯亮蓝试剂盒测定蛋白浓度。

1.6 ELISA检测血清和肝组织中TNF-α、IL-1β和IL-6含量

取-80 ℃冰箱保存备用的血清和冻存的肝组织，ELISA检测血清和肝组织中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，具体检测方法按试剂说明书操作。

1.7 HE染色观察肝组织形态学改变

石蜡切片二甲苯脱腊，梯度酒精浸水，苏木素伊红染色，脱水，中性树胶封片，光镜下观察肝细胞形态改变并摄像。

1.8 免疫组化检测肝组织中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表达

采用二步法 DAB 显色检测。操作步骤按试剂盒说明书进行，其中一抗稀释度为1∶200，以已知阳性片作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。

1.9 Western Blot方法检测肝组织中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表达

取冻存的肝组织，组织裂解，BCA法测定蛋白浓度，制胶，上样，电泳，转膜，封闭后加一抗，4 ℃孵育过夜，充分洗膜后，室温下二抗孵育 1 h，使用凝胶成像系统进行拍照，并用 Image J软件进行分析，结果以目的蛋白与β-actin相对表达量表示。

1.10 统计学方法

用SPSS 20.0统计软件包对实验数据进行描述性统计分析、方差分析等统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠体重检测结果

各组小鼠体重检测结果：正常组小鼠体重随饲养时间增加；与正常组比较，模型组和PBS组小鼠体重随时间明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，GDF-15组小鼠体重随时间增加明显上升，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

2.2 各组小鼠血糖检测结果

各组小鼠血糖检测结果：正常组小鼠血糖趋于稳定状态；与正常组比较，模型组和PBS组小鼠血糖随时间明显上升，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，GDF-15组小鼠血糖随时间增加明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表2 各组小鼠体重的变化

表3 各组小鼠血糖的变化

2.3 各组小鼠血清中ALT和AST检测结果

各组小鼠血清中ALT和AST检测结果：与正常组比较，模型组和PBS组小鼠血清中ALT和AST明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，GDF-15组小鼠血清中ALT和AST明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，见表4。

表4 各组小鼠血清中ALT和AST的变化

2.4 各组小鼠肝组织中TG、TC、SOD、MDA、HK及PK检测结果

各组小鼠肝组织中TG、TC、SOD、MDA、HK及PK检测结果：与正常组比较，模型组和PBS组小鼠肝组织中TG、TC、MDA明显增加，SOD、HK、PK明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，GDF-15组小鼠肝组织中TG、TC、MDA明显降低，SOD、HK、PK明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)，见表5。

2.5 各组小鼠HE染色结果

各组小鼠HE染色结果见图1。正常组肝细胞排列整齐，结构清晰，无病理改变；模型组和PBS组小鼠肝细胞出现大量脂肪空泡，提示糖尿病小鼠肝细胞中脂肪沉积；GDF-15组肝细胞中脂肪空泡明显减少。

2.6 各组小鼠血清和肝组织中TNF-α、IL-1β和IL-6检测结果

各组小鼠肝组织与血清中促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)检测结果：与正常组比较，模型组和PBS组小鼠肝组织与血清中TNF-α、IL-1β、IL-6明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，GDF-15组小鼠肝组织与血清中TNF-α、IL-1β、IL-6明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，见表6～7。

2.7 各组小鼠免疫组化染色结果

各组小鼠免疫组化染色结果见图2～4。正常组TNF-α、IL-1β、IL-6在肝血窦低表达；模型组和PBS组TNF-α、IL-1β、IL-6在肝细胞胞质高表达；GDF-15组TNF-α在肝血窦低表达，肝细胞胞质中未见明显表达，IL-1β、IL-6在肝细胞胞质低表达。

表5 各组小鼠肝组织中TG、TC、MDA、SOD、HK、PK的变化

A代表正常组：肝细胞结构清晰正常；B代表模型组：肝细胞内见大量脂肪空泡；C代表PBS组：肝细胞内见较多脂肪空泡；D代表GDF-15组：肝细胞内见极少量脂肪空泡

表6 各组小鼠肝组织中促炎因子的变化

表7 各组小鼠血清中促炎因子的变化

A代表正常组，TNF-α在肝血窦中低表达；B代表模型组，TNF-α在肝细胞胞质内大量表达；C代表PBS组，TNF-α在肝细胞胞质内高表达；D代表GDF-15组，TNF-α在肝血窦中少量表达

A代表正常组，IL-6在肝血窦中低表达；B代表模型组，IL-6在肝细胞胞质内大量表达；C代表PBS组，IL-6在肝细胞胞质内高表达；D代表GDF-15组，IL-6在肝血窦中有表达，在肝细胞胞质内少量表达

2.8 各组小鼠Western Blot检测结果

各组小鼠Western Blot检测结果：与正常组比较，模型组和PBS组小鼠肝组织中TNF-α、IL-1β、IL-6明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，GDF-15组小鼠肝组织中TNF-α、IL-1β、IL-6明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，见图5、表8。

图5 各组小鼠肝组织TNF-α、IL-1β和IL-6的表达

组 别TNF-α/β-actinIL-1β/β-actinIL-6/β-actin正常组0.33±0.020.08±0.010.13±0.01模型组1.24±0.14**0.52±0.04**0.44±0.05**PBS组 1.12±0.08**0.43±0.03**0.32±0.03**GDF-15组0.54±0.03##0.14±0.01##0.23±0.02##

3 讨 论

糖尿病肝损伤是糖尿病常见的并发症之一。对于T2DM的发病机制，目前还未见明确的阐述，主要涉及以下几个方面，如：糖脂质代谢异常、氧化应激、内质网应激、胰岛素抵抗、线粒体功能障碍、炎症反应[8-10]等等。研究显示，在糖尿病以及并发症中发挥重要作用的是炎症反应。当TNF-α、IL -1β、IL-6 等炎症细胞因子大量释放时，可导致糖尿病肝损伤加重，可由非酒精性脂肪肝病发展为非酒精性脂肪肝炎[11]。

转化生长因子GDF-15在体内有广泛的表达，其主要的分泌部位在肝脏和脂肪组织。有研究表明，GDF-15能使高脂饮食的小鼠体内脂肪含量降低[12]，同时可使机体能量消耗水平增加；还可通过抑制巨噬细胞活化减少炎症的发生。机体炎症反应时GDF-15水平会有代偿性增高，推测GDF-15可能对机体具有一定保护作用[5]1-5。本实验利用高脂饮食联合STZ诱导C57BL/6J小鼠糖尿病模型，就有关GDF-15对糖尿病小鼠肝损伤的保护作用进行了初步探索研究。

ALT和AST可作为肝细胞损伤的诊断标准之一。本实验血清中ALT、AST的检测结果显示，模型组明显升高，GDF-15组明显下降，说明GDF-15可明显改善糖尿病小鼠的肝功能。肝组织中糖尿病脂质代谢指标TG、TC的检测结果显示：模型组明显升高，GDF-15组明显下降，说明GDF-15可改善糖尿病小鼠的脂质代谢。HK、PK是调控糖酵解的一种酶，肝组织中HK、PK的检测结果显示，模型组明显降低，而GDF-15组明显上升，说明GDF-15能维持糖尿病小鼠血糖的相对稳定。糖尿病小鼠抗氧化指标SOD、MDA的检测结果显示，模型组SOD表达明显降低而MDA表达明显升高，GDF-15组SOD表达明显升高而MDA表达明显降低，表明GDF-15可通过提高机体抗氧化来保护肝脏。

在各种促炎症因子中，TNF-α是最重要的促炎介质之一，在胰岛素抵抗的发生和T2DM的发病过程中发挥着重要作用。TNF-α主要产生于脂肪细胞和(或)外周组织，通过参与产生ROS和激活各种转录介导的通路，诱导组织特异性炎症。TNF-α水平升高诱导脂肪细胞和外周组织的胰岛素抵抗，通过丝氨酸磷酸化削弱胰岛素信号，从而导致T2DM的发展。有文献报道[13]，通过抑制促炎细胞因子的表达来预防1型和2型糖尿病。本实验各组小鼠血清和肝组织中TNF-α、IL-6及IL-1β检测结果显示，模型组促炎症因子表达明显上升，GDF-15组促炎症因子表达明显下降；免疫组织化学染色和Western Bolt检测肝组织中NF-α、IL-6及IL-1β表达结果显示：模型组处于高表达，GDF-15组处于低表达。其实验结果与已有文献报道一致，说明GDF-15能抑制促炎细胞因子的表达。有关GDF-15介导改善糖尿病小鼠肝损伤的机制还需进一步的研究来阐明。