复合全氟三丁胺携氧材料的嗅鞘细胞移植促进大鼠周围神经损伤修复的研究

雷 可，雷 涛，朱 萌，邱 容，王 倩，梁卓文

周围神经损伤后虽然具有一定的再生能力，但是再生能力有限，在大部分再生神经重新到达并支配靶组织之前，远端靶组织就已发生萎缩[1-2]。 因此，如何加快神经轴突生长及功能恢复是困扰人们的难题。 嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)是一种特殊的嗅神经系统胶质细胞[3]，大量的研究表明，OECs 能够促进中枢以及外周神经系统神经再生[4-6]。 然而，细胞移植至神经损伤区域将面临缺氧微环境，进一步影响移植细胞活性，严重制约细胞移植的神经修复效果[7]。 因此，改善OECs 移植区域的局部微环境供氧非常必要。组织工程材料的发展，为解决这一问题带来了希望。 全氟碳化物(perfluorocarbons，PFCs)，如全氟三丁胺(perfluorotributylamine，PFTBA)能够高效提升组织材料中的氧含量，作为血液替代品广泛应用[8-9]。 多项研究表明，在低氧条件下，PFTBA 能提高不同类型的细胞活性及存活率[7，10]。 因此，PFTBA 成为一种有吸引力的补充材料，能够为移植在损伤区域的OECs 提供持续氧供，打破其缺氧微环境。 本研究将PFTBA 作为材料与Matrigel 混合为携氧材料与OECs 混合后植入聚己内酯(polycaprolactone，PCL)静电纺丝神经导管。 在体内条件下测试该复合物神经导管对大鼠坐骨神经1 cm 缺损的修复效果，为其在周围神经再生领域的应用提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料 选取6 ～8 周龄雄性SD 大鼠，10 只用于提取OECs，96 只用于体内实验。 所有大鼠均由空军军医大学实验动物中心提供，本实验已通过空军军医大学动物实验伦理委员会批准(KY20172005-1)。DF12(DMEM 和Ham′s F12 的1 ∶1混合物)细胞培养基、胎牛血清、青-链霉素(美国Gibco 公司)；胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液、Triton X-100(北京索莱宝科技有限公司)；左旋多聚赖氨酸(poly-L-lysine，PLL)、聚ε-己内酯(ε-caprolactone，PCL)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(美国Sigma-Aldrich 公司)；多聚甲醛(上海碧云天生物技术有限公司)；进口山羊血清工作液(北京中杉金桥生物技术有限公司)；SMA 单克隆抗体、p75NTR单克隆抗体、NF160 单克隆抗体(英国Abcam 公司)；山羊抗鼠Cy3、山羊抗兔FITC、山羊抗鼠FITC(北京康为世纪生物科技有限公司)。细胞培养瓶(广州洁特生物过滤股份有限公司)；石蜡切片机(德国LEICA 公司)；共聚焦显微镜(日本Nikon 公司)；透射显微镜(日本Hitachi 公司)；光学显微镜(日本Olympus 公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 SD 大鼠60 只，随机分为3组:自体神经移植组，PFTBA-OECs 神经导管组(PFTBAOECs组)；OECs 神经导管组(OECs组)，每组20 只。

1.2.2 OECs 的提取以及纯化 依照Goulart 等[11]总结的方法并加以少许改动，分离6 ～8 周龄的雄性SD 大鼠嗅球，并从中剥取嗅神经层及嗅粘膜。0.25%胰蛋白酶消化20 min。 终止消化，1000 r/min 离心5 min，使用含有10%胎牛血清的DF12 培养基重悬细胞，接种；36 h 后，取未贴壁的细胞悬液，接种至PLL 包被的培养瓶中，正常培养基继续培养7 d，贴壁细胞用于后续实验。

1.2.3 OECs 鉴定 纯化后的OECs，固定后进行免疫荧光染色，对SMA 和p75NTR进行特异性免疫荧光标记。 拍摄选取随机区域并计数SMA 和p75NTR均阳性细胞数量及DAPI 标记细胞核数量，两者之比计算OECs 纯度。

1.2.4 移植后细胞活性测试 使用慢病毒转染OECs 细胞[12]，使其表达绿色荧光蛋白，即GFP-OECs。术后3，7，14，28 d，将各组大鼠(每个时间点，每组大鼠9 只)神经移植物，纵断面冰冻切片，在荧光显微镜下对GFP-OECs 进行计数。 每个切片随机选取5 个视野(1000 μm×300 μm)用于分析。

1.2.5 坐骨神经再生评估 取各组大鼠坐骨神经移植物石蜡切片。 对切片进行免疫荧光染色，特异性标记NF200 和S100。 通过共聚焦显微镜收集免疫荧光染色结果。

1.2.6 再生神经轴突髓鞘化评估 将各组神经移植物处理后超薄切片，透射电镜观察并计算再生轴突的髓鞘厚度。

1.2.7 功能恢复评估 计算坐骨神经指数(sciatic function index，SFI)评估坐骨神经损伤后功能恢复，术后4、8 周，分别收集各组大鼠5 只可进行足迹测量。 用以计算SFI 值。

1.3 统计学处理 应用SPSS 24.0 统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，两组间比较使用t检验，多组间比较使用单因素方差分析；计数资料采用率表示，行χ2检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 自体神经移植组，OECs

神经导管组，PFTBA-OECs 神经导管组大鼠均存活，全部进入后续实验数据分析。

2.2 OECs 纯度 OECs 经过纯化后进行p75NTR和SMA 双标免疫荧光染色(图1)。 OECs 纯度(%)＝p75NTR和SMA 双标染色均阳性细胞数量及DAPI 标记的同一视野细胞核数量。 本研究所测得的OECs纯度为(95.8±2.1)%。

图1 OECs 免疫荧光染色鉴定

2.3 PFTBA 对移植OECs 成活率的影响 术后3、7、14、28 d 分别对GFP-OECs 计数。 PFTBA-OECs组GFP-OECs 数量在术后每个统计时间点均明显多于OECs组(P＜0.05)，图2。

图2 PFTBA 在体内条件下对OECs 存活率的影响

2.4 PFTBA-OECs 对神经再生的影响 术后4 周免疫荧光染色结果显示，自体神经组和PFTBAOECs组再生神经纤维在损伤远端也有分布，雪旺细胞数量也明显多于OECs组(P＜0.05)，图3。

2.5 PFTBA-OECs 对再生轴突髓鞘化的影响 术后4 周再生神经组织的透射电镜结果显示，PFTBAOECs组再生神经轴突的数量明显多于OECs组(P＜0.05)，与自体神经移植组接近；PFTBA-OECs组髓鞘厚度明显优于OECs组(P＜0.05)，图4。

2.6 PFTBA-OECs 对坐骨神经损伤后功能恢复的影响 术后2、4、8 周SFI 显示PFTBA-OECs组SFI值与自体神经移植组接近(P＞0.05)，明显优于OECs组(P＜0.05)，图5。

图3 PFTBA-OECs 对大鼠坐骨神经再生的影响

图5 术后2、4、8 周大鼠SFI 值统计图

3 讨论

OECs 能够促进中枢神经系统以及外周神经系统神经的再生以及生长[13-15]。 尽管OECs 移植能够在一定程度上促进神经的再生以及功能的恢复，但是移植后，局部微环境的恶化[16]，如缺氧、炎性反应等，致使移植细胞存活率低、生物活性差，严重制约了OECs促神经修复作用的发挥[7]。 因此，为移植细胞设计持续的供氧方案对于提高神经修复非常必要。

大量研究表明PFTBA 能够提高多种细胞在缺氧状态下的细胞活性。 因此，PFTBA 为组织工程修复神经缺损的局部缺氧提供了解决方法。 本研究发现复合有PFTBA 的OECs 在神经导管内存活率显著提高。 在大鼠坐骨神经损伤模型中发现PFTBA 能够有效打破移植局部缺氧微环境，显著促进再生轴突的生长，为再生神经轴突营造良好的再生微环境。

本研究还发现PFTBA-OECs 能够提升再生神经轴突的髓鞘化程度。 各处理组大鼠SFI 值表明，PFTBA-OECs 处理组大鼠的神经功能恢复情况明显优于OECs 处理组。 本研究的缺点是尚未就PFTBA对细胞活性影响促进神经再生的具体机制进一步探究。 下步实验将进一步深入了解PFTBA 促进神经再生的具体分子机制。

综上所述，本研究证实了PFTBA 在OECs 移植以及组织工程方法修复神经缺损过程中的有效性，为解决组织修复材料局部缺氧提供了解决方案，为进一步提高组织工程方法修复神经损伤疗效提供了新视野。