多西紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡及对PI3K/AKT 信号通路的影响

黎 矶，梁欢欢，邓 敏

卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤之一，隐匿性较强，大部分患者初期症状并不明显，确诊时已出现浸润[1]。 手术切除是首选治疗方式，可提高5 ～10年的生存期，但术后仍有转移、复发风险[2]。 随着治疗技术逐渐提高，卵巢癌及前癌性病变得到了有效的控制[3]。 多西紫杉醇是第二代紫杉烷类半合成抗肿瘤药物，通常被认定为抗肺癌药物的一线和二线治疗药物。 其抗癌原理在于加快微管蛋白物聚集，促进微血管稳定性和增强功能性微管束能力，对肿瘤细胞进行抑制和破坏[4]。 磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)是机体细胞中广泛存在的信号通路，与细胞生长、增殖、分化密切相关，而PI3K 的异常活化是细胞发生癌变的主要原因之一[5]。 G 蛋白偶联受体蛋白酪氨酸激酶受体可激活PI3K，激活产物影响AKT 活性使其呈现磷酸化，活性增强并激活下游一系列因子，影响细胞周期、凋亡，调控肿瘤血管新生[6]。 本研究探讨多西紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡及对PI3K/AKT 信号通路的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 Trizol 试剂(浙江联硕生物科技有限公司)，逆转录试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司)，BCA 蛋白浓度测定试剂盒(上海抚生实业有限公司)，RT-PCR 试剂盒(上海优予生物科技有限公司)，RPMI-1640 培养基(上海博升生物科技有限公司)，HO-8910 卵巢癌细胞株(上海奥陆生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 取HO-8910 细胞进行接种培养，初次接种细胞呈圆形，悬浮状态，1 d 后逐渐贴壁，2 d 后完全贴壁细胞梭形或多边形，7 d 后细胞密度生长至80%～90%融合度，予以传代培养，消化选用0.25%胰蛋白酶，利用吸管吹打，制成细胞悬液，移植新培养瓶中，继续培养收集第5 代细胞，将HO-8910 细胞稀释至1×105/mL，于16 孔板中平铺，待HO-8910 细胞密度生长为60%～80%时，吸出培养液进行后续实验。

将浓度为10、40、80 μg/mL 的多西紫杉醇培养液加入铺有HO-8910 细胞的16 孔板中进行培养，分为:Ho组(HO-8910 细胞＋生理盐水)、Hd组(HO-8910 细胞＋10 μg/mL 多西紫杉醇培养液)、Hz组(HO-8910 细胞＋40 μg/mL 多西紫杉醇培养液)、Hg组(HO-8910 细胞＋80 μg/mL 多西紫杉醇培养液)[7]，培养48 h 后，弃上清液，更换培养基，培养48 h 收集细胞。

1.2.2 RT-PCR 检测 分别取出4组Ho-8910 细胞，用Trizol 法提取DNA 反转录成cDNA，所有的逆转录反应按照说明书进行，将所得的cDNA 进行荧光实验。 PCR 反应条件:60 ℃预变性，10 min；95 ℃延伸，72 ℃退火，各30 s；95 ℃延伸，共循环40 次，实验次数不少3 次。 PI3K 正向引物5′-CATCACTT CCTCCTGCTCTAT-3′，反向5′-CAGTT2GTTGGCAAT CTTCTTC-3′；AKT 正向引物5′-GGACAACCGCCAT CCAGACT-3′，反向5′-GCCAGGGACACCTCCATCTC-3′；β-action 正向引物5′-GAGAGGGAAATCGTGCGT GAC-3′，反向5′-GACGTAGCACAGCTTCTCCTTAATG-3′；用相对定量2-ΔΔCt计算PI3K、AKT 水平。

1.2.3 Westernblot 法 在6 孔板中加入100 μg 的胰蛋白酶提取液，再注入2 mL 的培养基，将转染后的细胞放入EP 管中，并与胰蛋白酶提取液按照1 ∶100进行混合，冷冻10 min，使细胞完全裂变，成为E 溶液；在EP 管中按照1:100 比例加入胰蛋白酶提取液2 mL，使细胞完全裂变成为F 溶液，把E和F 溶液以80:1 的体积进行摇匀，配制成工作液，放入37.5 ℃的保温箱中20 min，冷却后计算PI3K、AKT 蛋白浓度。

1.2.4 流式细胞仪检测 将处理后的细胞放置于磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)中，予以洗涤，离心5 min，100 μL 的1×结合缓冲液，对细胞进行重悬，用5 μL 标记FITC 的AnnexinⅤ与5 μL PI 染色混匀，无光条件下，孵育15 min 后注入400 μL 1×结合缓冲液混匀，予以洗涤，次数3 次，记录细胞凋亡情况。

1.2.5 Transwell 检测 将4组细胞进行饥饿处理，12 h 后加入DMSO，24 h 后离心重悬细胞5×105/mL，准备Transwell 小室注入200 mL 细胞悬液，置入培养基中培养，离心经处理后的HO-8910 细胞3 ～5 min，将细胞接种在96 孔板上予以培养，每孔200 μL，室温37 ℃、5% CO2，培养时长不少于24 h，不大于72 h，加入MTT 培养不小于3 h，不大于4 h，与150 μL DMSO 溶液混匀，用酶标仪来检测490 nm 处光密度值(OD 值)，分析细胞活力变化情况。

1.3 统计学处理 应用SPSS 19.0 统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4 组间PI3K、AKT 水平情况 RT-PCR 检测显示:Ho组PI3K、AKT 水平高于其他3组，其余3组依次是Hd组、Hz组、Hg组，4组间PI3K、AKT 水平差异有统计学意义(P＜0.05)，图1。

图1 4组间PI3K、AKT 水平差异比较情况

2.2 4 组间PI3K、AKT 蛋白表达水平情况 Western Blot 检测显示:Ho组PI3K、AKT 蛋白表达水平最高，其余3组PI3K、AKT 蛋白表达水平从低至高依次为Hg组、Hz组、Hd组，4组间PI3K、AKT 蛋白表达水平差异有统计学意义(P＜0.05)，图2。

图2 4组间PI3K、AKT 蛋白表达水平差异

2.3 4 组HO-8910 细胞凋亡率情况 流式细胞仪检测显示:Hg组HO-8910 细胞凋亡率最高，其次为Hd组、Hz组，Ho组HO-8910 细胞凋亡率最低，4组HO-8910 细胞调亡率差异有统计学意义(P＜0.05)，图3。

2.4 4 组HO-8910 细胞迁移能力情况 Transwell

检测显示:Ho组HO-8910 细胞迁移能力最高，其余3组中HO-8910 细胞迁移能力Hg组迁移能力最低，Hz组迁移能力低于Hd组(P＜0.05)，Hg组较Hz组低(P＜0.05)，4组细胞迁移能力差异有统计学意义(P＜0.05)，图4。

2.5 4 组HO-8910 细胞增殖能力比较 MTT 检测显示:Hg组HO-8910 细胞增殖能力最低，Ho组细胞增殖能力最高，Hz组低于Hd组，4组细胞增殖能力差异有统计学意义(P＜0.05)，图5。

图3 4组HO-8910 细胞凋亡率比较

图4 4组HO-8910 细胞迁移能力情况

图5 4组HO-8910 细胞增殖能力

3 讨论

近年来，年轻女性卵巢癌发病率越来越高，且发病阶段有一定潜伏期，半数以上的患者未见明显临床症状，多在日常的妇科检查中发现或确认，因此，确诊时已处于进展阶段[8]。 多西他赛是一种半合成紫杉醇抗癌药物，渗漏效果良好，可透过癌细胞进入细胞和内部，通过调控微管蛋白聚集来控制病情[9]，而PI3K/AKT 信号对肿瘤的发生、发展有重要作用，有研究者深入证实PI3K/AKT 信号可促进淋巴血管形成，癌细胞增殖，使病情向不可控方向发展[10]。

近些年，PI3K/AKT 信号通路一直是众多学者研究的重点，它可以干预作用于多种细胞内表达，参与细胞的增殖和分化，并与众多疾病都存在不可分割的关系。 Yin 等[11]已证实Netrin-1 通过PI3K/AKT信号通路经受体neogenin 促进胃癌细胞增殖和侵袭，PI3K、AKT 参与细胞的增殖、侵袭和迁移。 有文献报道，PI3K 是AKT 的一个上游分子，通过PI3K发生磷酸化反应，磷酸化会促进肿瘤的生长和迁移[12]。 PI3K/AKT 作为机体内重要信号通路，PI3K活性增强，调控下游抗氧化蛋白，导致机体受活性氧的侵害，出现氧化应激反应[13]。 有研究证实，PI3K/AKT 信号在卵巢癌中有重要的作用，卵巢癌细胞中PI3K/AKT 信号相关蛋白表达受到抑制后，癌细胞的氧化和抗氧化就会失衡，卵巢癌细胞凋亡就会增多[14]。 PI3K/AKT 信号通路在众多肿瘤中被发现，如在胃癌和子宫内膜癌中的异常变化具有重要参考价值。 PI3K/AKT 信号被激活时，靶器官的分化受到限制，干细胞特异性被保留，会加快肺癌细胞的分化，导致肿瘤形成[15]。 本研究发现，Ho组PI3K、AKT 水平高于其他3组，其余3组Hd组PI3K、AKT最高，Hz组其次、Hg组最低。。

本研究发现，Hg组HO-8910 细胞凋亡率最高，其次为Hd组、Hz组。 Ho组HO-8910 细胞迁移能力最高，Hz组迁移能力低于Hd组，Hg组较Hz组低。 Hg组HO-8910 细胞增殖能力最低，Ho组细胞增殖能力最高，Hz组低于Hd组，Hg组增殖能力最弱。 江楠等[16]研究发现多西紫杉醇可使卵巢癌停留在G2/M 期，G2/M 期阻滞会促进RNA 的损伤修复，细胞内畸形染色体减少，抑制卵巢癌细胞增殖。陈涵等[17]研究表明多西紫杉醇对癌细胞的作用时间长，抗肿瘤活性能力较紫杉醇高，杀死组织内的癌细胞，加快药物吸收，在肿瘤细胞浸入其他器官之前将之杀死，从根本上减少了癌症复发和转移的可能性，且在铂类耐药的卵巢癌中有明显的作用。 也有研究发现多西紫杉醇还能与肝癌患者体内微管蛋白结合，对癌细胞的扩散进行有效抑制，对肿瘤的治疗有较高的临床应用价值[18]。

综上所述，多西紫杉醇可造成HO-8910 细胞大量凋亡，可能通过抑制PI3K/AKT 信号通路活性来实现的。 但本研究存在一定的不足，仅对HO-8910卵巢癌细胞株进行实验，未对细胞的迁移、凋亡进行多时间点的研究，今后应加入多种卵巢癌细胞系进行比较研究，以提高结论的准确性。