生物标志物指导下的抗肿瘤药物研发

邱国玉，许晓辉，贾汝玲，党子龙，马友振

国际抗癌联盟发布的《中低收入国家获得癌症治疗的现状——全球癌症防治的重要部分》调查报告指出，目前超过一半的肿瘤患者生活在中低收入国家，这一数字到2030年将上升到70%。肿瘤已成为我国城市和农村居民的第一位死因，我国肿瘤发病率正处于快速上升期，每年肿瘤发病人数约260万，死亡约180万[1]。目前全球各国已批准上市的抗肿瘤药物有130～150种[2-3]。抗肿瘤药物将是人类与肿瘤抗争的武器，也代表了目前人类抗击肿瘤的最高水准。在药物研发的过程中，由于不合适的药物靶点、不合适的分子、错误的结论、不匹配的患者导致了抗肿瘤药物研发的失败。从候选药物到成功应用于临床，药物需要经历临床Ⅰ期试验、临床Ⅱ期试验、临床Ⅲ期试验、上市申请及审批和上市后再研究5个研究阶段。在生物标志物指导下，候选药物临床Ⅰ期试验到临床Ⅱ期试验，临床Ⅱ期试验到临床Ⅲ期试验、临床Ⅲ期试验到上市申请及审批、上市申请及审批到上市后再研究的成功率都比没有生物标志物指导的成功率高，同时，候选药物临床Ⅰ期试验，生物标志物指导下开发药物的成功率是没有生物标志物指导的3倍[4]。抗肿瘤药物的研发仍然缓慢、昂贵和低效，解决这一问题的一种方法是使用预测性生物标志物。生物标志物在非临床药物开发中涉及广泛的学科、模式和开发阶段，主要是药物靶点的识别和评估，药物临床试验期间疗效研究。生物标志物作为探针对确定药物靶点、药物作用机理以及其他方面发挥着重要作用，对于精准研发抗肿瘤新药具有重要的意义[4]。在临床前药物研发的背景下，生物标志物可以客观地测量和评价指标的正常生物过程、病理过程、药物反应过程，这有助于监控药物治疗疾病的效果。随着人类基因组测序的完成和组学技术的发展，生物标志物在药物开发中的应用越来越广泛，生物标志物主要分布在以下器官、系统中，包括肝、胆、肾、心脏、肌肉系统、生殖系统、神经系统和免疫系统。作者综述了基于生物标志物的抗肿瘤药物活性筛选、药效动力学研究、临床疗效预测预后，以期为进一步研究开发新型抗肿瘤药物提供参考。

1 生物标志物

生物标志物是基于免疫学和分子生物学技术而发展起来的与细胞生长增殖有关的标志物，包括蛋白质、核酸、代谢衍生物等在内的诸多分子都可以成为潜在的生物标志物。肿瘤生物标志物是肿瘤直接产生或由身体对肿瘤特定响应分泌的物质，这些物质或过程的存在表明肿瘤存在于人体[5]，肿瘤生物标志物的识别与检测对于研究药物活性与作用机理非常重要，可以准确的预测药物药理活性，同时也可减少药物研发和临床试验的时间和成本。新型抗肿瘤药物筛选的首要步骤是体外与体内活性筛选，其筛选使用的常见生物标志物有：细胞毒性生物标志物[6]、基因生物标志物[7]，蛋白表达生物标志物，影像学生物标志物[8]。目前，大多数抗肿瘤药物的研发模式都是基于生物标志物的药理活性研究为目标，以药物对该肿瘤模型的标志物的影响作用与大小为依据，通过检测药物作用于肿瘤或者肿瘤模型后，生物标志物上调或者下降用来预测被研究抗肿瘤药物药理作用[9-10]。而代谢组学提供了发现内源性生物标志物的机会，这些标志物可以追踪代谢途径，分别对小鼠进行稳定同位素标记和未标记给药，并收集对照动物的尿液，在主成分分析的基础上，对这三个尿组进行了非靶向质谱代谢组学分析[11]，该方法也适用于药物毒性机制研究。目前，用于寻找和鉴定生物标志物的方法有：二代基因组测序、生物信息学突变分析、体内和体外药效动力学标记鉴定、定量免疫印迹法，流式细胞技术、免疫组织化学检测、脱氧核糖核酸测序等。同时，生物信息学技术的发展也为寻找筛选抗肿瘤药物的生物标志物开辟了另一条通路，比如生物信息学技术与实验相结合的方法可用于寻找抗肿瘤药物活性筛选的生物标志物[12]。

2 基于生物标志物研究抗肿瘤药物

生物标志物的寻找包括两个关键过程，一个是发现生物标志物并建立适用的生物标志物检测方法；二是确立生物标志物与被研究肿瘤药物之间的关联关系或因果关系。唯有满足这两个条件的生物标志物才有资格运用到抗肿瘤药物研究中[9]。目前，新药研发成本不断提高，研发技术在逐渐进步，新药的申报数却在下降，面对这一形势，开发一些基于计算机设计兼具生物安全性和高效性的特定类别抗肿瘤药物筛选的生物标志物显得非常重要，而基于生物标志物研究抗肿瘤药物主要是预测抗肿瘤药物药理活性、研究药效动力学/药代动力学和药物疗效预测预后。

2.1 预测抗肿瘤药物药理活性 一个化合物在成为候选药物之前，必须经过一系列体内体外生物活性筛选，最终才能做为候选药物。在筛选候选药物的前期，候选药物特定生物标志物该类型药物与靶标结合效果的评估，药效的评估起着重要作用。目前，抗肿瘤药物筛选的靶点主要有微管蛋白、端粒酶、DNA拓扑异构酶、调节细胞信号传导通路等。抗肿瘤药物首要的研究目标是发现药物作用靶点，而生物标志物发现应用是去预测与评估抗肿瘤药物与靶点作用的药效效果[13]。抗肿瘤药物主要的生物标志物是基因突变，因此发现抗肿瘤药物作用于肿瘤细胞基因组的DNA序列变异是寻找到被试验抗肿瘤药物生物标志物的关键，虽然研究者利用先进的测序技术对肿瘤细胞进行基因测序，发现了大量的基因变异，但是研究者对这些基因突变在肿瘤发生发展的病理作用方面仍然知之甚少。

2.2 研究药效动力学/药代动力学 生物标志物结合药代动力学可以确证靶标与疾病的关系，从抗肿瘤药物受体靶点、组织器官、整体动物等多个层次的生物效应表达加以关联，阐释抗肿瘤药物药效物质基础及作用机制，并指导临床实践。同时，根据全面系统的研究结果发现与药效、药性表达密切相关的生物标志物，用于质量控制，指导剂量的选择，抗肿瘤药物治疗的药效学结果常被用来证实药物靶向生物反应，其分析方法有质谱分析、免疫组织化学，最广泛使用的是抗原特异性抗体检测[14]。与药效动力学/药代动力学相关的是膜转运体，膜转运体包括ATP结合盒转运体蛋白家族(ATP binding cassette,ABC)和溶质运载摄取转运蛋白家族2大超家族，在机体稳态调控中起着核心作用。ABC家族主要包括P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白和乳腺癌耐药蛋白等，主要发挥外排转运的作用[15]，转运蛋白家族包括有机阴离子转运多肽，有机阴离子转运蛋白、有机阳离子转运蛋白、葡萄糖转运体等，主要发挥运载摄取的作用。在这些膜蛋白中，药物载体被广泛研究，药物转运体涉及药物吸收、分布和排泄的各个方面。研究发现，几种ABC转运蛋白在多种肿瘤中高度过表达，在肿瘤多药耐药表型的形成中发挥重要作用，一些转运体多态性已经被证明可以改变临床药物的药代动力学特征。因此，药物转运体是药物动力学和药代动力学的生物标志物。同时，当转运蛋白功能受损时，转运蛋白底物也可以作为生物标志物[16]。Yamagata等[17]发现Abcg2基因敲除小鼠拓扑替康的吸收速率增加了2倍，体内暴露量增加了3.6倍，进一步证明了乳腺癌耐药蛋白转运体对拓扑替康的口服生物利用度的作用。由于肿瘤的异质性、环境因素和遗传因素，个体间的抗肿瘤药物反应各不相同，而遗传因素可以影响抗肿瘤药物的药代动力学和药效学，导致局部和全身药物暴露和(或)药物靶点功能的改变，改变药物反应，因此，一些药物遗传生物标志物已经在抗肿瘤药物药效动力学/药代动力学实践中得到应用。然而，许多遗传生物标志物处于发现阶段，需要解决的问题是改进遗传生物标志物的翻译，这将涉及使用标准化表型和基因分型策略、协同工作、识别和复制关联的多学科方法[18]。另外，通过药效动力学/药代动力学研究可以更为全面和准确地了解药物的效应随剂量(浓度)及时间而变化的规律，获得药效暴露量、起效时间及维持时间，为临床试验的给药剂量和给药间隔提供重要的参考依据[19]。同时，药效动力学/药代动力学数据结合毒代动力学数据在临床前推测药物的安全范围。回顾性分析表明用暴露量计算的安全范围比用剂量准确。

2.3 药物疗效预测预后 抗肿瘤靶向药物(anticancer target drugs,ATDs)特异性结合和抑制在肿瘤发生和进展中发挥重要的分子靶向作用，在细胞内信号通路中具有重要的作用。到目前为止，数百种不同的ATDs在不同的国家被批准用于临床。与以往的化疗相比，ATDs的不良反应更小，效率更高，但成本也更高。然而，ATDs对晚期肿瘤的治疗效果仍显不足。不同的ATDs有不同的作用机制，在不同的患者身上疗效不一样。因此，需要个性化的方法来为个别患者选择最佳的ATDs候选方案。目前，研究者开发出了能够预测单个肿瘤对ATDs反应的生物标志物：分子通路激活。细胞毒性T淋巴细胞抗原干扰肿瘤特异性效应细胞如CD8细胞，导致其克隆扩增，去除肿瘤诱导的调节性T细胞(Treg)，其常被用作抗肿瘤药物筛选的生物标志物。Vonderheide等[20]在Ⅰ期临床试验中发现,Tremelimumab联合依西美坦可使26例ER+/HER2-乳腺癌患者中的11例病情稳定12周或更长,最佳客观缓解率为42%。研究发现多数患者血清中CD4+和CD8+T细胞表达诱导性共刺激因子水平及ICOS+T细胞/FoxP3+Treg细胞比例明显上升,表明细胞毒性T淋巴细胞抗原信号通路成功阻断。而高通量基因表达谱的成功应用和新型生物信息工具的出现，促进了分子生物医学通路相关领域的快速发展[21]。批准的肿瘤药物靶向于肿瘤细胞中的离散分子畸变或通路，因此在患者群体的一个子集上是活跃的，但临床研究表明，并非所有的生物标志物对阳性患者都有反应。因为预测生物标志物出现不断发展的耐药机制，不仅要指导特定治疗中患者亚群的选择，而且要识别新的治疗靶点。将基因组学、转录组学和受体状态评估纳入生物标记药物联合开发过程中，超越“一种标记，一种药物”的模式，有助于分子标记肿瘤治疗的成功应用[22]。另一方面，内源性或获得性耐药、药物不良反应和肿瘤患者之间及肿瘤内部的异质性限制了抗肿瘤药物对晚期肿瘤治疗的临床效果，为了克服这些障碍，应用预测性生物标志物来指导医生选择对各种抗肿瘤治疗有反应的肿瘤患者，并提高毒性效益比。但是对于一些天然来源的抗肿瘤药物，如曲贝替定、卡巴他赛和夫拉平度，生物标志物预测其临床治疗效果仍然发展缓慢[23]。

3 总结

抗肿瘤药物作用机理的研究大多是在细胞株和动物模型中建立完成的，但人体是一个多细胞多器官的高度复杂的生物体，很多疾病的致病机制涉及到多个生物信号传导通路且不同器官会有不同的机理，这是临床前药物研发所用的体外试验体系很难模拟的。另外，生物信号传导通路常涉及到靶标以外的多个基因，这都使得常用的只以单一原研药物靶标为生物标志物有很大的局限性。