BMSCs对IRI大鼠肾小管病理、ROCK蛋白水平的影响

孙瑞华，都 渝，鲍巧玲

急性肾衰竭(Acute Renal Failure，ARF)在临床上非常多见，占ICU的10%～30%，虽然肾脏替代治疗技术有了很大的提高，但在过去的10年内病死率仍然在50%以上[1]。缺血再灌注损伤(Ischemia Reperfusion Injury，IRI)是临床上导致缺血性ARF的主要原因之一，在肾移植过程中IRI不可避免，且会影响术后肾功能恢复，引起急、慢性排斥反应，也会影响移植物长期的存活[2]，因此，研究IRI的病理生理过程，探索其中的分子生物学机制，寻找有效的保护和干预措施具有重要意义[3]。Gholamreza等[4]研究发现，在心脏、肝脏、肾脏和肺中注入骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)可减轻器官的IRI。BMSCs和其它细胞相比获得的渠道更广，并且分离后更容易传代培养[5]。Zare等[6]证实，BMSCs可有效的治疗肾小管损伤，主要的治疗机制为BMSCs能分化肾小管的上皮细胞，并且促进肾内细胞的增殖，从而改变细胞因子的环境和旁分泌水平。Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho Associated Coiled Coil Forming Protein Kinase，ROCK)又称Rho激酶，属于丝氨酸/苏氨酸激酶，与Rho组成Rho/ROCK信号[7]，研究发现ROCK与干细胞生物学密切相关[8]。ROCK信号活化在干细胞的增殖、迁移、分化及干性维持等方面发挥重要作用[9]。研究显示[10]，ROCK信号主要与BMSCs的成骨分化、角化细胞分化、神经系统损伤修复和迁移有关，而ROCK在肾组织中的表达还尚不明确，本研究建立肾IRI大鼠模型，对模型大鼠进行BMSCs移植，分析其对大鼠的肾小管病理影响，观察ROCK蛋白在肾组织中的表达并分析BMSCs对ROCK蛋白的调控情况。

1 材料和方法

1.1 实验动物 本实验所用雄性大鼠共30只，购自广东省医学实验动物中心，生产许可：SCXK(粤)2013-0002。所有大鼠均健康没有任何疾病，体质量在180～200 g之间，大鼠常温下适应性饲养7 d。

1.2 试剂和仪器 ROCK抗体(美国Sigma公司)；DMEM-F12、10%胎牛血清(美国Gibco公司)；DAPI、TUNEL检测试剂盒(上海罗氏制药有限公司)；电热恒温水浴箱(北京长安科学仪器厂)；图像扫描仪(美国A1pha公司)。

1.3 BMSCs的分离、培养、鉴定和标记 分别取出大鼠的股骨和胫骨的骨髓，用Percoll分离液进行分离，全部过程要求在无菌条件下进行。用胎牛血清的DMEM-F12悬浮液将细胞悬浮，放置在37 ℃、5% CO2孵育箱中培养。48 h后，弃掉未贴壁的细胞，当所有的细胞长到80%时，将细胞进行消化并转代，进行扩增培养，多次进行传代后对细胞进行纯化处理。流式细胞仪检测第三代细胞CD34、CD44、CD45和CD166的表达，细胞活力采用台盼篮染色方法进行测定。取出3～6代大鼠的BMSCs后，加入无菌DAPI，最终的浓度为50 mg/mL，37 ℃孵育30 min后进行离心处理，用PBS溶液进行洗涤，6次后将没有完全结合的DAPI全部除去。收集离心后的细胞用无血清的DMEM-F12进行稀释，将稀释后的细胞用荧光显微镜观察，当DAPI显示为蓝色荧光时，冰浴保存，1 h后将细胞注入到大鼠的体内。

1.4 动物分组与模型建立 把实验所用的30只健康大鼠随机分为三组，sham组为假手术组，IRI组为肾IRI大鼠模型组；BMSCs组为肾IRI大鼠模型加BMSCs干预组，每组各10只。所有大鼠术前禁食12 h，用2%的戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉，大鼠固定在操作台上，用恒温加热垫控制大鼠的体温保持在37 ℃，沿大鼠的腹部中位线切开，分离大鼠的左侧肾蒂，用无损伤的血管夹阻闭肾蒂，并用定时器进行计时，用4-0丝线进行间断缝合，暂时关闭大鼠腹腔。阻断左侧肾蒂1 h后，把血管夹移除，开放肾动脉血流，可观察到肾脏迅速或在短时间内由暗黑色逐渐变为鲜红色，表示再灌注成功。Sham组大鼠除不用血管夹阻闭肾蒂外，其它的手术步骤同另外两组相同。手术后三组大鼠连续注射3 d青霉素溶液，以防止术后感染。

再灌注1 h后，将4×106个BMSCs制作成1 mL的细胞悬浮液，经大鼠的尾静脉注射；sham组和IRI组大鼠注射1 mL的生理盐水，三组大鼠连续注射7 d进行后续实验。

1.5 标本采集 用10%的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉所有大鼠，每只大鼠取心脏内全血3 mL，放置在抗凝管内静置，4 ℃静置6～8 h，7 000 r/min离心5 min，分离血浆用以检测血肌酐(Serum Creatinine，SCr)和尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)含量。取部分的肾脏组织，用于大鼠的肾组织病理检测、细胞增殖、凋亡检测及蛋白检测。

1.6 生化指标检测 分别取出大鼠的血清，对三组大鼠的SCr和BUN进行检测。用苦味酸法检测大鼠的SCr水平，酶法测定大鼠的BUN水平，所有的步骤严格按照试剂盒的说明书进行。

1.7 肾组织病理学形态观察 对三组大鼠的生化指标检测后，分别处死大鼠，取出大鼠肾脏组织，用甲醛固定梗死组织，固定24 h后切片，石蜡切片的厚度为4 μm，脱蜡后进行HE染色并观察。

1.8 免疫组化(SP)检测肾小管上皮细胞增殖细胞核抗原的表达 将肾组织石蜡包埋后进行切片处理，并对切片组织进行脱蜡和脱水处理，用枸橼酸缓冲液缓冲后放置在高温的微波炉中进行修复，时间为20 min。将山羊血清加入其中，封闭后加入一抗，将其放置在4 ℃的环境中过夜，然后加入二抗，最后用DAB和苏木素进行染色，脱水后进行透明处理，用中性树胶将其封片，最后会发现呈棕黄色的阳性产物。在高倍显微镜下，随机选取每个切片的20个清晰视野，对增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)阳性细胞进行计数。PCNA=阳性细胞数/所有细胞的总数×100%。

1.9 TUNEL检测肾小管上皮细胞凋亡 取出大鼠的肾组织，分别切成0.5 cm的块状，将块状组织固定后用石蜡进行包埋，最后把块状的组织进行切片。用TUNEL法把石蜡切片进行染色，所有的步骤按照试剂盒上的说明严格进行。每张石蜡切片选取5个不交叉的视野进行观察，凋亡的心肌细胞为深棕色。

1.10 Western Blot检测大鼠RhoA和ROCKⅠ蛋白的表达 将三组大鼠的肾组织分别提取100 mg，将细胞进行裂解并提取核蛋白，并对核蛋白的浓度进行测量，分装后，保存在-20 ℃的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液进行混匀，按照4∶1的比例进行，为了让蛋白质变性需将蛋白溶液全部进行煮沸处置。在电泳板内分别注入50 μm的蛋白样品，把电泳后的样品转移到PVDF膜上，加入脱脂奶粉后封闭，时长为1 h。加入一抗后进行TTBS漂洗，每次漂洗10 min，漂洗3次，最后加入二抗对溶液进行稀释，常温的环境中封闭1 h。取出PVDF膜，TTBS每次漂洗10 min，漂洗3次，DAB溶液显色后数码相机照相。

2 结果

2.1 三组大鼠生化指标比较 IRI组大鼠的生化指标SCr和BUN水平显著高于sham组(tSCr=7.850，tBUN=23.61，均P<0.001)；BMCSs组大鼠的SCr和BUN水平明显低于IRI组大鼠(tSCr=6.031，tBUN=12.58，均P<0.001)，表1，图1。

表1 三组大鼠SCr和BUN生化指标比较

图1 三组大鼠SCr和BUN生化指标比较与sham组比较，*P<0.05；与IRI组比较，#P<0.05

2.2 三组大鼠的肾组织病理学形态比较 Sham组大鼠的肾小管和肾小球的结构没有任何损伤现象。与sham组比较，IRI组大鼠的肾小管出现了严重损伤，肾小管的官腔有明显的扩张现象，肾小管上皮细胞也出现了肿胀和坏死现象，管型呈红细胞或颗粒状，肾间质有大量的出血和水肿。和IRI组大鼠比较，BMSCs组大鼠的肾单位损伤较轻，肾组织情况得到了明显的改善，图2。

图2 三组大鼠肾组织病理学变化(HE染色，×400)

2.3 三组大鼠肾小管上皮细胞PCNA的比较 和sham组比较，IRI组大鼠PCNA阳性表达显著降低(t=5.774，P<0.001)；BMSCs组大鼠的阳性细胞数量显著多于IRI组大鼠(t=3.979，P<0.001)，提示BMSCs能有效的促进肾小管上皮细胞的增殖，加快肾脏组织修复，图3、图4。

图3 三组大鼠免疫组化染色比较肾小管上皮细胞增殖(免疫组化染色，×400)

图4 三组大鼠PCNA阳性表达比较与sham组比较，*P<0.05；与IRI组比较，#P<0.05

2.4 三组大鼠肾小管上皮细胞凋亡 与sham组比较，IRI组大鼠肾小管上皮细胞出现大量的凋亡(t=14.80，P<0.001)；BMSCs组大鼠肾小管上皮细胞的凋亡数量得到显著抑制(t=9.079，P<0.001)，图5、图6。

图5 三组大鼠肾小管上皮细胞凋亡(TUNEL染色，×400)

图6 三组大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况比较与sham组比较，*P<0.05；与IRI组比较，#P<0.05

2.5 Western Blot检测大鼠RhoA蛋白和ROCKⅠ蛋白表达比较 与sham组大鼠的比较，IRI组表达显著增加(tRhoA=3.631，tROCKⅠ=3.258，均P<0.05)；BMSCs组大鼠的RhoA蛋白和ROCKⅠ蛋白表达显著低于IRI组(tRhoA=2.543，tROCKⅠ=2.627，均P<0.05)，图7、图8。

图7 三组大鼠RhoA蛋白和ROCKⅠ蛋白表达

图8 三组大鼠RhoA蛋白和ROCKⅠ蛋白表达比较与sham组相比较，*P<0.05；与IRI组比较，#P<0.05

3 讨论

IRI是指组织缺血后的再灌注不能缓解组织损伤，反而加重组织结构破坏和代谢障碍，其可能的机制有氧自由基生成、能量代谢障碍、炎性递质含量和活性改变等[11]。肾脏急性IRI是发生急性肾功能衰竭的重要危险因素，急性肾功能衰竭致死率高，治愈率低，一部分患者在治疗后会长期存在肾功能不全或发展至终末期肾病[12]。缺血和缺氧等多种因素都会引起肾小管损伤，当肾小管上皮细胞内聚集大量的代谢终产物或者外源性的化学物质时，会引发细胞的毒性反应，损伤肾小管功能，严重时会导致肾小管出现急性坏死，甚至导致肾功能衰竭[13]。所以，在临床上找到有效治疗肾脏IRI的方法是目前的研究热点。BMSCs是成体干细胞中的一种，目前己被证实在组织损伤中具有良好的保护作用。本研究建立肾脏IRI大鼠模型，移植BMSCs干预后观察大鼠肾小管病理改变，以及肾组织中ROCK蛋白的表达。

肾脏功能会随着肾脏IRI的发生而降低，而机体血清中BUN和SCr的水平能有效的反应肾功能变化[14]。肾小球的滤过率会随着肾功能不全而逐渐降低，肾小管重吸收和分泌功能出现障碍会聚集过多的含氮代谢产物，进而会增加血液中非蛋白氮含量。本研究结果显示，IRI组大鼠的SCr水平和BUN水平显著增高；BMCSs组大鼠的SCr和BUN水平明显低于IRI组大鼠。提示，BMSCs可有效抑制IRI大鼠血液中非蛋白氮的含量，并且降低BUN水平，从而改善大鼠肾功能。肾组织病理结果显示，IRI组大鼠肾小管出现了严重损坏，肾小管的官腔有明显扩张现象，其上皮细胞出现了肿胀和坏死的现象，管型呈红细胞或颗粒状，肾间质大量出血和水肿。与IRI组大鼠比较，BMSCs组大鼠的肾单位损伤较轻，肾组织情况得到了明显的改善。提示BMSCs移植对大鼠肾小管结构的破坏有一定的防护作用，同时有效的改善了IRI导致的肾损伤，为BMSCs移植用于临床治疗提供了理论依据。刘红等[15]通过对IRI大鼠研究发现，低氧预处理后的BMSCs移植，对改善IRI大鼠的肾功能更为有效，同时还能对肾组织损伤进行有效修复，这种修复能力可能与其分泌HGF和bFGF等有关。

真核细胞DNA在合成时需要一种核蛋白，而PCNA就是其中最重要的一种[16]。当细胞在静置状态时，其中PCNA含量非常低；当细胞进入增殖周期时，PCNA表达会显著增高，所以可以用PCNA的表达来反应细胞的增值状态，细胞增值的活跃程度也可以用PCNA表达的高低来反映[17]。本研究发现，BMSCs移植后该组大鼠的PCNA阳性细胞数量显著增加。王志剑等[18]通过对急性缺血肾损伤的大鼠研究发现，移植BMSCs后大鼠肾小管上皮细胞PCNA阳性细胞数量显著多于对照组，PCNA是评价细胞增殖状态的一个较为成熟的指标，因此，提示BMSCs移植可以促进缺血性损伤后肾小管细胞的增殖，更有助于缺血性损伤后肾小管结构完整性的维持与修复。

Rho激酶是参与细胞运动的主要激酶之一，调节细胞的分裂、迁移、分泌等活动。Rho高表达和过度激活与许多心脏、肾脏血管疾病密切相关，ROCK是最早发现的Rho效应物，在分子水平，ROCK表达上调促进炎症、氧化应激、血栓形成和纤维化的各种因子，下调内皮型一氧化氮合酶。在细胞水平ROCK介导血管平滑肌细胞收缩，促进增殖和迁移；在肾脏中主要以ROCK-Ⅰ形式存在，ROCK-Ⅰ抑制剂能抑制肾脏纤维化，进而改善IRI。本研究结果显示，与sham组大鼠RhoA蛋白和ROCKⅠ蛋白表达比较，IRI组大鼠的表达显著增加；BMSCs组大鼠RhoA蛋白和ROCKⅠ蛋白表达显著低于IRI组。可见，移植BMSCs可有效的抑制RhoA蛋白和ROCKⅠ蛋白表达，从而保护肾脏IRI。李忠伟等[19]研究发现，BMSCs移植和Rho/Rock信号通路阻断剂均可促进脊髓修复及神经功能的恢复，且BMSCs移植联合Rho/Rock信号通路阻断剂具有更好的疗效，两者之间存在一定的协同效应。孟建中等[20]通过对IRI大鼠研究发现，阻断Rho/Rock信号通路可有效的改善IRI内皮免疫微环境，减轻肾组织损伤。

综上，BMSCs可有效保护肾脏IRI导致的肾小管损伤，同时抑制肾组织中ROCK蛋白表达，从而对肾脏起到保护作用。