“生物药”——Wharton’s jelly源间充质干细胞

高连如

·述评·

“生物药”
——Wharton’s jelly源间充质干细胞

高连如

干细胞治疗代表生物冶疗进入到了一个崭新的时代。间充质干细胞是存在于胚胎或成体组织中来源于中胚层具有多向分化潜能的干细胞。由于成体间充质干细胞的质量与数量自身缺陷，使之应用受到了很大限制。Wharton’s jelly组织，是起始于胚胎发育第13天的胚外中胚层组织。使用基因微阵列分析及功能分析，首次发现Wharton’s jelly源间充质干细胞（Wharton’s jelly derived mesenchymal stem cells，WJMSCs）高表达胚胎早期干性基因及心肌细胞分化早期特异转录因子，可分化心肌细胞等多种细胞。进而，应用临床级WJMSCs经冠状动脉移植治疗ST抬高型急性心肌梗死患者的随机双盲临床试验，首次证明WJMSCs可明显改善心肌活力及心脏功能。因此，WJMSCs具有极其重要益处；无伦理涉及，有强的分化潜能，无致瘤性；加之，WJMSCs可作为产品，在任何时候病情需要时立即应用。为此，WJMSCs作为真正意义上的干细胞族，将最有希望成为具有应用前景的干细胞生物药。

间充质干细胞；Wharton’s jelly源间充质干细胞；生物药物

［Abstract］Cell-based treatment represents a new generation in the evolution of biological therapeutics.Mesenchymal stem cells（MSCs）are mesoderm-derived multipotent stromal cells that reside in embryonic and adult tissues.The use of adult MSCs is limited by the quality and quantity of host stem cells.Wharton’s jelly of the umbilical cord originates from the extraembryonic and/or the embryonic mesoderm at day 13 of embryonic development.Using Affymetrix GeneChip microarray and functional network analyses，we found for the first time that Wharton’s jelly-derived MSCs （WJMSCs），except for their expression of stemness molecular markers in common with human ESCs （hESCs），exhibited a high expression of early cardiac transcription factor genes and could be induced to differentiate into cardiomyocyte-like cells.Further，we demonstrated for the first time that intracoronary delivery of prepared clinical-grade WJMSCs was safe in treating patients with an STAMI attack by double-blind，randomized controlled trial and could significantly improve myocardial viability and heart function.It is therefore important to consider the benefits of WJMSCs，which are not ethically sensitive，have differentiation potential，and do not have the worrying issue of teratoma formation.Moreover，as the off the shelf product，WJMSCs can be applied immediately，and on demand.Thus，WJMSCs constitute a true stem cell population and are promising cells as a biological drug for stem cell-based therapies.

［Key words］Mesenchymal stem cells（MSCs）；Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells（WJMSCs）；Biological drug

21世纪，人类疾病治疗模式在继现代医学——药物、手术、机械辅助等手段后，一个崭新的充满希望的新理念——细胞生物治疗理论诞生了，这将给人类带来什么样的变化与影响，如此快速之进展，正如Science、Nature中所表述的“即使站在世界最前沿的科学家也难以预料”［1-2］。干细胞再生医学正是在这日新月异的科学进展中不断更新传统治疗理念。干细胞是一类未分化的细胞或原始细胞，具有自我复制、能够分化成为至少1种功能细胞的早期未分化细胞。在一定的条件下，干细胞可以定向分化成机体内的功能细胞，形成任何类型的组织和器官，即具有“可塑性”。根据在个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞可分为胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）和成体干细胞。当受精卵分裂发育为囊胚时，内层细胞团的细胞即为ESCs。ESCs虽然有最好的分化潜能，但涉及伦理道德、潜在免疫和致瘤风险还不能应用于临床。2006年Takahashi 和Yamanaka［3］首个建立了诱导型多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS），将自体成体细胞经基因工程改造为类似ESCs的具有多向分化潜能的iPS，至今已10年，虽对iPS寄予了极大希望，但目前研究发现，iPS由于基因整合如c-myc基因，或基因插入突变，及对肿瘤抑制基因的分裂作用等不良因素存在，具有明显致瘤风险［4］，以致iPS至今难以应用于临床。成体干细胞，是指那些具有组织或器官特异性的干细胞，具有很强的可塑性，组织类型非常广泛，是目前较为理想的再生医学种子细胞［5］。

1 间充质干细胞

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于中胚层具有自我更新、多向分化潜能及特殊免疫调节功能的一个重要的干细胞成员。MSCs广泛存在于成体及胚胎组织中，如脂肪、肌肉、肺、心脏、血液、牙龈、胎盘、子宫内膜、羊膜、Wharton’s jelly。MSCs有一个广泛分化谱，它可以向骨、软骨、脂肪、心肌细胞、血管内皮、肌肉、肾小管、神经元、肝细胞/岛细胞的中胚层、外胚层、内胚层细胞分化。正是由于MSCs广泛分化潜能，使它在再生医学代替修复病损及衰竭的组织器官上占有特殊重要地位［5］。不仅如此，MSCs广泛旁/自分泌功能，分泌多种细胞因子、生长因子、生物活性肽介导参与了多脏器修复与重建效应。MSCs最独特之处是特殊的免疫调节功能，这使它在多种自身免疫疾病治疗上已崭露头角［5］。而最为重要的是，经广泛基础研究及初期临床研究发现，MSCs体内应用安全性好，无突变致瘤性。因此，作为目前最具应用前景的“生物药”——MSCs，国际上已注册400多项临床研究。

2 自体成体间充质干细胞的缺陷

2014年Science、Nature相继发表2篇文章引起世界震动，即科学家将年轻小鼠的血液输给了老年小鼠，结果发现年轻小鼠血液中的干细胞帮助老年小鼠恢复了肌肉和神经功能［6-7］。然而，衰老的自身干细胞却难以获得如此效果。现众多基础研究证据表明，成体MSCs随着年龄增长其端粒酶长度进行性缩短，尤其合并各种病理状态时，MSCs的抗氧化应激能力逐渐减弱，凋亡增加，存活增殖能力及分化潜能明显下降，以致其无论是再生能力还是免疫调节功能均显著減低［8］。在对一组急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者行经冠状动脉自体骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）移植的随机对照临床试验中，首次发现AMI患者尤其老年患者BMSCs数目及增殖能力明显减低，以致AMI患者BMSCs移植后6个月、1年既未能显著缩小梗死范围，也未能明显改善心功能及限制心室重构［9］。因此，摆在临床面前一个重要且急需解决的问题是如何获得富有生命力的MSCs。胚胎外组织，新生儿出生后遗留的组织如胎盘、脐带、Wharton’s jelly、脐血、羊膜、绒毛膜正是介于胚胎与成体组织之间的具有原始特性的组织［10-11］。

3 Wharton’s jelly源间充质干细胞

3.1Wharton’s jelly源间充质干细胞的特殊组织来源 Wharton’s jelly起源于胚胎发育13 d时的中/内胚层。此时，卵黄囊壁的胚外中胚层内由间充质干细胞密集而成的细胞团即血岛，血岛周边细胞分化为内皮细胞，内皮细胞围成的内皮管即原始血管，血岛中央的游离细胞分化为原始造血细胞，内皮管不断向外出芽延伸，逐渐形成一个丛状分布的内皮管网，分布于胚体内外的间充质中，称之为“心血管系统发源地”“干细胞池”。此后，随胚胎发育遗存于脐带内2条动脉、1条静脉间的胶状组织即Wharton’s jelly组织［12］。

3.2Wharton’s jelly源间充质干细胞的多能干细胞生物学特性 Wharton’s jelly源间充质干细胞（Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells，WJMSCs）在标准培养条件下黏附于塑料制品生长；表达CD44、CD73、CD90、CD105、人类白细胞抗原ABC；不表达CD45、CD34、人类白细胞抗原DR；体外可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞；故其符合国际细胞治疗学会规定的MSCs标准。而WJMSCs增殖能力远远高于BMSCs，集落形成单位是BMSCs的300倍（3 000/ 106比10/106），原代培养仅需6～8 d。WJMSCs分泌大量细胞因子、生长因子远高于BMSCs，如分泌肝细胞生长因子是BMSCs的31.3倍（12 569.8± 710.2比402.6±203.0）、分泌粒细胞刺激因子水平是BMSCs 1 677倍（1 845.0±881.0比1.1±0.3），与BMSCs基因对比分析显示WJMSCs表达胚胎干细胞基因标志的NANOG、DNMT3B和GABRB3，而BMSCs通常不表达［13-14］。应用全基因微阵列与ESCs对比分析发现，WJMSCs不仅表达多种胚胎干细胞标志基因，如OCT4、SSEA3、SSEA4、Nkx2.5、KLF4、FLK1、SOX2、NANOG、MYC、TERT、REX1、CRIPTO DAPPA4、TRA-1-8、Isl-1，而特征性高表示心肌特异转录因子Isl-1、Nkx2.5、Flk-1［15］。WJMSCs具有显著心肌细胞分化潜能，在体外WJMSCs与鼠胎儿心肌细胞共培养5 d，50%以上形成规律跳动的心肌细胞，呈现同步协调收缩，有电偶联［动作电位（186±12）ms］，表达特异心肌细胞标志物α-肌动蛋白、肌钙蛋白T、转录因子GATA-4、间隙连接蛋白43。当WJMSCs与小鼠缺血心肌组织共培养时，WJMSCs可与小鼠心肌组织整合［16-17］。WJMSCs在体外内皮细胞培养基中培养7 d，分化为表达CD133、血小板-内皮细胞黏附分子、血管内皮生长因子受体、血管性血友病因子标志的典型内皮细胞；14 d分化为鹅卵石样单层内皮，可形成毛细血管网、微血管。当把Wharton’s jelly间充质干细胞来源的内皮祖细胞移植到股动脉损伤（用金属丝损伤）的小鼠，小鼠受损的股动脉迅速内皮化，14 d新生膜与中膜面积比值明显减少，表明其可修复内皮并显著抑制内膜增殖［18-19］。以上表明WJMSCs可向不同细胞分化，分化为心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞。这种分化特征在其他成体MSCs中均未见过。因此，越来越多研究者认为WJMSCs是真正意义的原始干细胞、iPS［20］。

3.3WJMSCs特殊的免疫学性质 WJMSCs虽然具有ESCs某些生物学特性，但关键不同的是WJMSCs具有独特的免疫学特性，WJMSCs仅表达人类白细胞抗原ABC，不表达人类白细胞Ⅱ类抗原、人类白细胞抗原DR，协同刺激抗原CD80、CD86而表达人类白细胞抗原G，从而抑制免疫杀伤自然杀伤细胞、调节T淋巴细胞，达到免疫调节、抗炎症反应，而无免疫源性。WJMSCs移植后整体免疫学观察:①动态混合淋巴细胞培养实验发现，WJMSCs对异体淋巴细胞有明显抑制增殖反应功能；②外周血T细胞亚群检测，流式细胞仪动态检测移植后大鼠周围血T淋巴细胞CD3、CD4、CD8均无刺激增加［21］。Rachakatla等［22］将大剂量的WJMSCs通过不同途径，经静脉和皮下注射移植到严重免疫缺陷的小鼠，移植后50 d进行多脏器、多组织病理学检测，寻找肿瘤证据，结果无任何异常组织病理改变发现，无致瘤性倾向。

3.4WJMSCs治疗急性心肌梗死随机双盲安慰剂对照临床试验 在完成WJMSCs治疗慢性缺血性心力衰竭Ⅰ期临床试验后［21］，在国内11家心脏中心，入选160例ST抬高型AMI患者，剔除43例（因多种原因），116例ST抬高型AMI发病12 h内成功支架置入血流重建（心肌梗死溶栓3级）患者，由计算机统一随机双盲分配。①WJMSCs组:冠状动脉介入治疗术后第5天行经冠状动脉WJMSCs移植术，即在梗死相关冠状动脉经导丝球囊导管在阻断血流下分4次共灌入6×106WJMSCs。②对照组:安慰剂除细胞外的溶液，灌注方法相同。移植后4个月应用检测心肌活力金标准18F-氟脱氧葡萄糖正电子发射计算机断层显像及99mTc-单光子发射计算机断层成像检测心肌再生与灌注，发现心肌活力绝对值增加［（6.9±0.6）%、95%置信区间（confidence interval，CI）5.7～8.2比（3.3±0.7）%、95%CI 1.8～4.7，P＜0.000 1］；心肌灌注绝对值增加［（7.1±0.8）%、95%CI 5.4～8.8比（3.9±0.6）%、95%CI 2.8～5.0，P=0.002］；左室射血分数持续改善，至18个月左心室射血分数绝对值增加［7.8±0.9（6.0～9.7）比2.8± 1.2（0.4～5.1），P=0.001］。最为突出的是WJMSCs治疗显著限制了心室重构，18个月左室收缩末容量及舒张末容量均显著低于对照组（P分别为0.000 4、0.004）［23］。研究呈现心肌梗死范围缩小与心功能改善、心室重构限制一致性效应［23］，显著优于其他临床研究［24-25］。安全性18个月随访，无任何不良事件发生，异基因WJMSCs体内移植未触发免疫反应［23］。

3.5目前WJMSCs其他临床研究 ①Ⅰ型糖尿病:一个双盲临床研究，入选15例新发生的Ⅰ型糖尿病，经静脉输入（1.5～3.2）×107WJMSCs 2次后，20% （3/15）的患者停止了胰岛素应用、53%（8/15）的患者胰岛素用量减至50%，还有20%（3/15）的患者胰岛素用量減为15%～50%，已持续24个月［26］。②Ⅱ型糖尿病:一个非安慰剂对照临床研究，22例Ⅱ型糖尿病患者中17例胰岛素依赖患者，经WJMSCs 106/kg 2次移植，6个月随访17例中7例停用胰岛素，另9例胰岛素用量减少50%或50%以上，均伴糖化血红蛋白逐渐減低，血中炎性因子明显减低［27］。③系统性红斑狼疮:一组典型严重系统性红斑狼疮患者40例，给予106/kg WJMSCs 2次移植，12个月随访，其中24例症状包括蛋白尿、临床症状、实验室指标、系统性红斑狼疮指数明显缓解，无任何不良反应，仅少数患者效果不明显［28］。④其他免疫性疾病、器官移植抗排斥反应均显示其良好治疗效果。尤其是对长期因应用免疫抑制、激素所遭受不良反应磨难的患者，WJMSCs特殊的免疫调节功能可抑制B细胞产生过多抗体损害自身组织，抑制效应及细胞毒性T淋巴细胞增殖破坏自身组织，提高抑制性调节性T细胞数目，增加白介素-10及转化生长因子-β炎症抑制因子分泌，最终达到免疫平衡状态，终止了自身免疫反应［29］。

3.6WJMSCs临床应用的特殊地位 鉴于上述研究，ESCs、多能干细胞尚不能应用于临床。成体干细胞，尤其是老年人及在各种病理条件下，患者自身成体干细胞存在数量少、增殖能力差、剂量与功能不足，又是有创性取材，不能满足临床需求。WJMSCs取材于脐带，为出生后遗弃物，无伦理道德问题、取材方便、规范标准制备、可靠冻存、随时应用，尤其是WJMSCs独特的类似原始iPS的生物学特性，无免疫源性、无致瘤性，构成了异体干细胞临床应用的特殊地位。如AMI患者，细胞移植可在最佳时间窗进行；冠状动脉支架置入术后可早期快速内皮化及预防再狭窄。尤其在心血管再生医学、免疫调节及糖尿病等治疗上显示出其极其重要的应用前景，受到了国际社会广泛高度关注［30］。

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“Biological drug”:mesenchymal stem cells derived from umbilical cord

GAO Lianru
（Heart Center，Navy General Hospital，Beijing 100048，China）

R329.2+4

A

2095-3097（2016）04-0193-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2016.04.001

国家863项目（2011AA020102、2013AA020101）

100048北京，海军总医院心脏中心（高连如）

（2016-07-08 本文编辑:徐海琴）