微小核糖核酸-21对乳腺癌MCF-7细胞反转录富含半胱氨酸蛋白表达的调节研究

郑志伟，赵树林，杨钰贤，朱辉德，朱志伟，陈 蕾

·基础研究·

微小核糖核酸-21对乳腺癌MCF-7细胞反转录富含半胱氨酸蛋白表达的调节研究

郑志伟，赵树林，杨钰贤，朱辉德，朱志伟，陈 蕾

目的 探讨乳腺癌MCF-7细胞中微小核糖核酸-21（microRNA-21，miR-21）对反转录富含半胱氨酸蛋白（reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs，RECK）表达的调控作用。方法 将miR-21模拟物、miR-21抑制物及模拟物阴性对照、抑制物阴性对照各组瞬时转染到MCF-7细胞中，48 h后通过荧光定量聚合酶链反应检测miR-21在细胞的表达情况，蛋白质印迹法检测转染后RECK表达水平变化。结果 细胞转染48 h后，miR-21抑制物组和miR-21模拟物组miR-21的表达分别与转染空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.001），转染miR-21抑制物组miR-21的表达明显下降，转染miR-21模拟物组miR-21的表达明显上调；细胞转染miR-21各组后RECK表达差异有统计学意义（P＜0.01），miR-21抑制物组相对其阴性对照组，RECK表达明显上升（P＜0.001）；miR-21模拟物组相对其阴性对照组，RECK表达明显下降（P＜0.001）。结论miR-21可以抑制乳腺癌MCF-7细胞RECK表达，可能成为判断乳腺癌患者预后的评价指标及肿瘤治疗的新靶点。

乳腺癌；微小核糖核酸-21；反转录富含半胱氨酸蛋白

［Abstract］Objective To explore the effects of microRNA-21（miR-21）on the expression of reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs（RECK）in MCF-7 cells.Methods

MCF-7 cells were cultured in vitro and transfected with miR-21 mimics and miR-21 inhibitor by cationic-mediated transfected.The total RNA and protein were extracted from the culture cells after transfected forty-eight hours.The expression of miR-21 and RECK levels were detected by fluorescent quantitative PCR and Western blotting.Results The miR-21 expression was significantly changed after forty-eight hours transfected（P＜0.001），miR-21 expression decreased significantly in miR-21 inhibitor group while miR-21 expression increased significantly in miR-21 mimics group. The RECK was significantly changed after transfected（P＜0.001），RECK expression increased significantly in miR-21 inhibitor group（P＜0.001）while RECK expression decreased significantly in miR-21 mimics group（P＜0.001）.Conclusion miR-21 can inhibit the expression of RECK in breast cancer cells，and it may be a new target to judge the prognosis of breast cancer patients and the new target of tumor therapy.

［Key words］Breast cancer；MicroRNA-21（miR-21）；Reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs（RECK）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。城市地区女性乳腺癌每年新发病例约15.8万，占全部女性癌症发病的19.47%，发病率为46.74/10万，位居女性肿瘤发病之首。2011年中国女性乳腺癌发病人数约24.9万，发病率37.86/10万，近10年乳腺癌病死率呈上升趋势［1］。微小核糖核酸-21（microRNA-21，miR-21）是miRNAs家族成员之一，miR-21高表达与乳腺癌临床分期、淋巴结转移、浸润等恶性行为具有正相关性，因而进一步开展miR-21对乳腺癌分子生物学调控的研究。通过生物信息学软件TargetScan预测，反转录富含半胱氨酸蛋白（reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs，RECK）基因有可能是其调节的靶基因之一。RECK基因是一种新型基质金属蛋白酶抑制剂。研究发现，RECK基因作为新型的肿瘤转移抑制基因，能够有效地抑制肿瘤的侵袭与转移［2-3］。有临床研究进一步证明，RECK基因表达水平的高低与许多恶性肿瘤患者的预后密切相关［4］。尽管生物信息学分析提示miR-21对RECK基因的表达可能有调控作用，但两者间的明确关系目前尚鲜见报道。因此，本研究拟通过在乳腺癌细胞MCF-7中上调和下调miR-21表达，观察miR-21 对RECK表达的影响，明确miR-21对RECK表达的调控作用，为进一步研究miR-21调控的靶基因及其生物学机制提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂和仪器 达尔伯克改良伊格尔培养基［Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM，赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司］，胎牛血清（美国Invitrogen公司），胰酶（杭州吉诺生物医药技术有限公司），miR-21引物（苏州吉玛基因股份有限公司），Trizol试剂（美国 Invitrogen公司），Prime-Script反转录试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］，SYBR®Premix［天根生化科技（北京）有限公司］，胰蛋白酶乙二胺四乙酸溶液（0.05%胰蛋白酶+ 0.1 mmol/L乙二胺四乙酸，美国HyClone公司），Lipofectamin2000转染试剂（美国Invitrogen公司），聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶配置试剂盒（江苏碧云天公司），蛋白标准品（德国Thermo公司），牛血清白蛋白（美国Sigma-Aldrich公司），细胞总蛋白裂解试剂盒（德国Thermo公司），Bradford法蛋白定量试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］，miR-21抑制物、miR-21模拟物（上海吉玛制药技术有限公司），RECK一抗（美国ProteinTech公司），β-肌动蛋白一抗（美国Millipoer公司），异硫氰酸荧光素标志二抗（抗兔，美国Immunology Consultants Laboratory，Inc），X线片显影液、定影液（上海冠龙照相器材公司）。超净工作台（美国Nuaire公司），6孔板、培养瓶、冻存管（美国Corning Incorporated公司），倒置显微镜（日本Olympus公司），BP61电子天平（德国Sartorius），二氧化碳（CO2）培养箱（美国Thermo Electron Corporation），AvantiTM30低温高速离心机（美国Beckman公司），普通聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（德国Eppendorf公司），Engine Opticon 2荧光定量仪（美国MJ Research公司），VE-180垂直电泳槽（上海天能科技有限公司），VE-186转移电泳槽（上海天能科技有限公司），DY-B1脱色摇床（上海沪西仪器厂）。

1.2方法

1.2.1细胞培养 MCF-7细胞株由本实验室冻存细胞库中复苏培养。细胞用含10%胎牛血清的DMEM，在37℃、5%CO2培养箱常规培养，细胞铺满瓶底80%～90%时进行常规传代。

磷酸盐缓冲液漂洗后加入每瓶0.5 mL的0.25%胰酶，37℃孵育消化1min，用5mL冲洗培养基（DMEM 含5%胎牛血清）冲洗并终止消化，转移至15 mL离心管中，1 200 r/min，4℃离心5 min。细胞悬液按5× 105/mL置于6孔板中培养，当细胞达到50%～70%融合时进行实验。

1.2.2细胞转染实验

1.2.2.1干扰序列设计合成 采用化学合成的miR-21抑制物和miR-21模拟物分别用于抑制和上调MCF-7细胞的miR-21的表达，观察其对MCF-7细胞RECK的影响。RNA单链寡核苷酸由苏州吉玛基因股份有限公司化学合成。

miR-21抑制物序列:5′-UCAACAUCAGUCUGA UAAGCUA-3′；抑制物阴性对照序列:5′-CAGUACUU UUGUGUAGUACAA-3′；miR-21模拟物序列:正义链5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′，反义链5′-AA CAUCAGUCUGAUAAGCUAUU-3′；模拟物阴性对照序列:正义链5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反义链5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.2.2.2转染效率检测 转染前1 d，取对数生长期细胞，胰酶消化，DMEM悬浮细胞至密度为1× 105/mL，铺板于6孔板中，每孔1 mL，补加DMEM至2 mL，37℃、5%CO2培养箱中培养。培养24 h后，6孔板换培养基，采用Lipofectamin2000介导转染miR-21抑制物，按照表1进行转染。具体操作严格按照说明书进行，6 h后荧光显微镜下观察结果并记录。

表1　转染剂量

1.2.2.3细胞转染 在荧光显微镜下观察，20 pmol转染效率可达到70%以上，选择20 pmol的miRNAs作为实验用量。分别将miR-21抑制物、抑制物阴性对照、miR-21模拟物、模拟物阴性对照各组转染到6孔培养板MCF-7细胞中，未经任何处理的为空白对照组。于37℃、5%CO2培养箱中培养，48 h后分别以Trizol试剂和蛋白裂解液提取细胞中总RNA和总蛋白。实时荧光定量PCR检测干扰后细胞miR-21的表达水平，采用参照基因△Ct法分析，以U6看家基因表达PCR的Ct值作为相对标准，目的基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）相对表达水平计算公式:2-Δ（目的基因Ct-内参基因Ct）。

1.2.2.4蛋白质印迹法检测转染后MCF-7细胞内RECK表达水平 细胞转染48 h后，在每孔细胞中加入全蛋白裂解液裂解细胞获得蛋白，总蛋白样品各20 μg和5×磷酸盐缓冲液混匀后，100℃沸水煮5 min。裂解上清用二辛可宁酸试剂盒定量蛋白量，制备12%的分胶液，微量加样器上样20 μg总蛋白，300 mA转膜90 min，5%脱脂奶粉/含吐温-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris-buffered saline with Tween-20，TBST）室温，摇床缓慢摇动，封闭60 min，洗膜3次，用稀释比例为1∶1 000的RECK一抗孵育，4℃过夜，TBST洗膜3次、每次10 min。用辣根过氧化物酶标志的异硫氰酸荧光素标志二抗（抗兔）1∶5 000孵育，摇床缓慢摇动，室温60 min。用TBST洗膜3次、每次10 min，暗室下电化学发光显色、曝光，观察结果。

将完成显影的胶片扫描，以TIF格式储存，Fluor Chem 8900软件分析印迹条带灰度，记录平均灰度值。以目的蛋白RECK条带平均灰度值/β-actin平均灰度值作为目的蛋白表达的相对高低值。

1.3统计学处理 应用SPSS 13.0软件，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间差异采用单因素方差分析，采用LSD进行多重比较，若方差不齐则采用Brown-Forsythe近似方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义，统计检验均为双侧概率检验。

2 结果

2.1miR-21转染效率 转染到细胞中带绿色荧光标志的miR-21抑制物在细胞质中显示绿色荧光，在用1 μL Lipofectamin2000转染20 pmol miR-21抑制物时，效率即可达到70%左右（图1）。

图1　荧光标志检测miR-21抑制物转染效率（×200）

2.2细胞转染后miR-21的表达 通过细胞转染，抑制和上调MCF-7细胞的miR-21表达，转染48 h后，miR-21抑制物组和miR-21模拟物组miR-21的表达分别与转染空白对照组相比差异有统计学意义（F分别为30.79、139.68，P＜0.001），转染miR-21抑制物组miR-21的表达明显下降，转染miR-21模拟物组miR-21的表达明显上调（表2）。

2.3蛋白质印迹法检测细胞转染后RECK的表达miR-21抑制物组与抑制物阴性对照组比较，RECK表达明显上升（F=93.76，P＜0.01）；miR-21模拟物组与模拟物阴性对照组比较，RECK表达明显下降（F=82.63，P＜0.01）。蛋白质印迹法检测相对表达量和条带分别见表2和图2。

表2　细胞转染后miR-21及RECK表达（±s）

表2　细胞转染后miR-21及RECK表达（±s）

注:与抑制物阴性对照组比较，*P＜0.001；与模拟物阴性对照组比较，#P＜0.001

组 别　miR-21　RECK抑制物空白对照组　1.12±0.16　1.00±0.00模拟物空白对照组　1.21±0.15　1.00±0.00抑制物阴性对照组　1.03±0.25　0.80±0.03模拟物阴性对照组　1.14±0.61　1.02±0.33 miR-21抑制物组　0.02±0.01*　1.42±0.94*miR-21模拟物组　106.79±18.59#　0.74±0.03#

图2　干扰miR-21表达后细胞RECK表达（±s，n=3）

3 讨论

乳腺癌是女性高发的恶性肿瘤之一，远处转移是患者致死的最重要原因。乳腺癌的转移是一个多基因参与、通过多步骤完成的复杂过程，其具体机制尚未明确。miRNAs是近年发现的一类长度约22个核苷酸非编码小分子RNA，通过靶mRNA降解或抑制其翻译来调节靶基因的表达，在细胞的分化、增殖、迁移、侵袭和转移、个体发育、机体代谢，以及肿瘤、病毒感染多种疾病中都具有重要作用［5］。

RECK基因是新发现的一种膜表面糖蛋白，该基因位于9p13-p12。研究证实，RECK基因的表达与胃癌、食管癌、乳腺癌的预后具有相关性，RECK基因表达阴性的预后较差，反之RECK基因表达阳性的预后较好［6］。因此，RECK是一种抑癌基因，可负向调控肿瘤的转移或侵袭。

miRNAs调控基因表达的机制之一是通过与靶基因mRNA的3′端非翻译区相结合，通过降解靶基因mRNA起到生物学调节功能的作用。作者通过在线的生物信息学预测软件，发现miR-21 5′端的种子序列可以与RECK 3′-非翻译区靶向互补，因此推测RECK可能是miR-21调节的靶基因之一。有研究表明，RECK基因表达水平与乳腺癌细胞侵袭力存在相关性，RECK基因的表达可以作为乳腺癌患者预后的一个指标［7］。基于RECK基因在肿瘤组织的表达可以影响肿瘤侵袭、转移和血管生成，所以影响RECK基因的表达，有望成为在预防和治疗肿瘤侵袭和转移的新靶点。

miR-21在多种实体肿瘤及非实体肿瘤中均呈现高表达，在乳腺癌中也不例外［8-9］。越来越多的研究发现，miR-21不仅在肿瘤发生中起类似癌基因的作用，更重要的是其参与肿瘤的侵袭和转移。Yan等［10］发现乳腺癌中miR-21高表达，且与乳腺癌的临床病理特征如分期、淋巴结转移显著相关。Petrovic′等［11］也发现高侵袭性乳腺癌患者miR-21呈现高表达，miR-21的高表达有可能成为乳腺癌高侵袭性的独立分子标志物，且miR-21高表达与乳腺癌临床分期、淋巴结转移、浸润等恶性行为具有正相关性，因而进一步研究miR-21如何通过分子调节机制来对乳腺癌的侵袭起预测作用。

欣喜的是在TargetScan中发现miR-21 5′端的种子序列可以与RECK 3′-非翻译区靶向互补，RECK基因有可能是miR-21调节的靶基因之一。本实验通过设计miR-21模拟物、miR-21抑制物、模拟物阴性对照、抑制物阴性对照各组瞬时转染到MCF-7细胞中，48 h后通过荧光定量PCR检测miR-21在细胞的表达情况，发现转染miR-21抑制物组miR-21的表达明显下降，转染miR-21模拟物组miR-21的表达明显上调。确认细胞中miR-21干扰表达成功后，提取细胞蛋白，通过蛋白质印迹法检测细胞转染后RECK的表达，发现miR-21抑制物组RECK表达有明显上调趋势，miR-21模拟物组RECK表达明显下降趋势。因此，有理由推断，RECK基因有可能是miR-21调节的靶基因之一，miR-21可以作为乳腺癌诊断预后分析的标志物，也可能成为治疗的新靶点之一。

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MicroRNA-21 regulates expression of reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs in MCF-7 cells

ZHENG Zhiwei1，ZHAO Shulin1，YANG Yuxian2，ZHU Huide1，ZHU Zhiwei1，CHEN Lei2
（1.Department of Pharmacy，Cancer Hospital of Shantou University Medical College，Shantou Guangdong 515041，China；2.Department of Gastroenterology，Cancer Hospital of Shantou University Medical College，Shantou Guangdong 515041，China）

R737.9

A

2095-3097（2016）04-0198-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2016.04.002

汕头大学医学院附属肿瘤医院青年科研基金资助项目（2013A004）；广东省乳腺癌诊治研究重点实验室种子基金资助项目（2012A061400018）；汕头市科技计划资助项目（汕市财教〔2013〕244号）

515041广东汕头，汕头大学医学院附属肿瘤医院药学部（郑志伟，赵树林，朱辉德，朱志伟），消化肿瘤内科（杨钰贤，陈 蕾）

陈 蕾，E-mail:zhiweizheng@126.com

（2016-04-11 本文编辑:徐海琴）