八宝景天总黄酮的提取及对α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

孙陶利，许晓辉，卢新华

八宝景天总黄酮的提取及对α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

孙陶利，许晓辉，卢新华

目的 比较3种提取八宝景天总黄酮的方法，探讨提取的八宝景天总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。方法 采用水提法、醇提法和超声法提取八宝景天总黄酮，用盐酸-镁粉反应、薄层色谱进行定性鉴别；用紫外分光光度计测定八宝景天总黄酮含量；建立96微孔板高通量筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的模型，测定不同方法提取的八宝景天总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果 3种方法提取的八宝景天总黄酮盐酸-镁粉反应均显紫红色，3种样品在槲皮素对照品色谱相应位置上均有显示相同颜色的斑点，色谱斑点分离好，显色清晰；水提法、醇提法和超声法提取八宝景天总黄酮含量分别是（2.80±0.46）%、（5.62±0.56）%、（5.30±0.62）%，醇提法和超声法提取总黄酮含量比水提法高（P＜0.05）；水提法、醇提法和超声法提取的八宝景天总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别是（38.30±1.54）%、（69.27±6.67）%、（61.23±5.20）%，与水提法、超声法相比，醇提法得到的总黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制率最高（P＜0.05），与阳性药阿卡波糖相当（P＞0.05）。结论 70%乙醇回流提取八宝景天总黄酮含量高，对α-葡萄糖苷酶抑制活性强。

八宝景天；总黄酮；α-葡萄糖苷酶；提取；抑制

［Abstract］Objective To compare three extract methods of total flavonoids from Sedum spectabile Boreau，and explore its α-glucosidase inhibitory activity.Methods The water，ethanol and ultrasonic extract methods were used to extract total flavonoids from Sedum spectabile Boreau，qualitative identification used hydrochloric acid-magnesium powder reaction and TLC，the content of total flavonoids was determined by ultraviolet spectrophotometer.The model of 96 microplate highthroughput screening for α-glucosidase inhibitor was established，which was used to determine the αglucosidase inhibitory activity of total flavonoids from Sedum spectabile Boreau.Results Three total flavonoids from Sedum spectabile Boreau were all showed purple in hydrochloric acid-magnesium powder reaction，and the corresponding location on TLC were the same color of the spots，the spots were separated well and the color was clear.Three contents of total flavonoids from Sedum spectabile Boreau，extracted by water，alcohol and ultrasonic were（2.80±0.46）%，（5.62±0.56）%and （5.30±0.62）%respectively.The contents of total flavonoids extracted by ethanol and ultrasonic were higher than those by water extract method（P＜0.05）.The α-glucosidase inhibitory rates of three kinds of total flavonoids were（38.30±1.54）%，（69.27±6.67）%and（61.23±5.20）%respectively.Compared with total flavonoids extracted by water and ultrasonic，total flavonoid extracted by alcohol showed the better α-glucosidase inhibitory activity（P＜0.05），which was comparable to the positive drug acarbose（P＞0.05）.Conclusion High content of total flavonoids from Sedum spectabile Boreau is extracted by 70%ethanol reflux，and shows potent α-glucosidase inhibitory activity.

［Key words］Sedum spectabile Boreau；Total flavonoids；Alpha-glucosidase inhibition；Extraction；Inhibition

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药品与试剂 八宝景天（青州香艳花卉苗木园艺场），pH 6.8自配的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS），阿卡波糖（每片50 mg，德国拜耳公司）；无水乙醇（分析纯），槲皮素（上海哈灵生物科技有限公司），AB-8大孔吸附树脂（西安蓝晓科技有限公司），α-葡萄糖苷酶（美国Sigma公司），4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-Nitrophenyl-α-D-galactopyranoside，pNPG，美国Sigma公司）。

1.1.2仪器 UV-9000紫外分光光度计（上海分析仪器厂），离心机（TGLW16，上海赵迪生物科技有限公司），酶标仪（Thermo MK3，上海赛默科技生物发展有限公司），旋转蒸发仪（RE52CS型，上海亚荣生化仪器厂），干燥箱（101A-2，上海康路仪器设备有限公司），电子分析天平（AUY220型，日本岛津仪器有限公司）。

1.2方法

1.2.1八宝景天总黄酮的提取

1.2.1.1水提法 称取八宝景天茎叶200 g，加入3 000 mL去离子水，料液比1∶15，煎煮3次，每次2 h。合并水提液，减压浓缩，95%乙醇沉降除去水溶性杂质，滤过，滤液浓缩至干，取少许于试管中，盐酸-镁粉反应鉴别为紫红色，其余溶液减压浓缩，干燥，得八宝景天总黄酮粗品。AB-8大孔吸附树脂纯化，得八宝景天总黄酮（样A）。

1.2.1.2醇提法 称取八宝景天茎叶200 g，加入3 000 mL 70%乙醇，料液比1∶15，回流提取3次，每次2 h。合并提取液，减压浓缩，干燥，取少许于试管中，盐酸-镁粉反应鉴别为紫红色，即为八宝景天总黄酮粗品。AB-8大孔吸附树脂纯化，得八宝景天总黄酮（样B）。

1.2.1.3超声法 称取八宝景天茎叶200 g，加入3 000 mL 70%乙醇，料液比1∶15，常温下超声（80 Hz）提取3次，每次2 h。合并提取液，减压浓缩，干燥，取少许于试管中，盐酸-镁粉反应鉴别为紫红色，即为八宝景天总黄酮粗品。AB-8大孔吸附树脂纯化，得八宝景天总黄酮（样C）。

1.2.2八宝景天总黄酮的定性鉴别

1.2.2.1理化鉴别 盐酸-镁粉反应，取少许样A、样B、样C粉末，溶于1 mL甲醇中，加入少许镁粉振摇，滴加几滴浓盐酸，1～2 min后观察，显紫红色。

1.2.2.2薄层色谱鉴别 取样A、样B、样C粉末约50 mg，加甲醇10 mL，超声处理15 min，过滤，取续滤液作为供试品溶液；另取槲皮素标准对照品2 mg，加10 mL甲醇溶解，作为标准对照品溶液。分别吸取上述溶液10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，使成圆点状，采用盐酸饱和后的甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）为展开剂展开，取出，晾干，分别在日光及365 nm紫外光灯下检视。

1.2.3标准曲线制备及方法学验证

1.2.3.1对照品溶液的配制 精密称取120℃干燥至恒重的槲皮素对照品1.8 mg置于50 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，4℃冰箱内保存备用。

1.2.3.2样品溶液的配制 精密称取样A、样B、样C各50 mg置于50 mL容量瓶中，加入无水乙醇40 mL，超声（80 Hz）10 min，取出，放至室温，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取滤液即得。

1.2.3.3检测波长的选择 精密吸取对照品溶液和样A、样B、样C溶液各5.0 mL于50 mL容量瓶中，加无水乙醇定容，混匀，在190～400 nm扫描，对照品和样A、样B、样C溶液在370 nm均有最大吸收峰，检测波长选择370 nm。

1.2.3.4线性关系考察 精密吸取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于50 mL容量瓶中，加无水乙醇定容，摇匀，于370 nm处测定其吸光度（absorbence，A），以A为纵坐标，质量浓度C （μg/mL）为横坐标进行线性回归，得方程为 A=0.065 1C+0.048 3（r=0.999 2），线性范围为0.36～3.6 μg/mL。

1.2.3.5日内精密度实验 精密吸取对照品溶液2.0 mL于50 mL容量瓶中，加无水乙醇定容，摇匀，测定其A370值，连续测定6次，以A370值计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.31%，日内精密度良好。

1.2.3.6日间精密度实验 精密吸取对照品溶液2.0 mL于50 mL容量瓶中，加无水乙醇定容，摇匀，测定其A370值，连续测定5 d，以A370值计算RSD为0.38%，日间精密度良好。

1.2.3.7稳定性实验 精密吸取样A、样B、样C溶液各2.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加无水乙醇定容，摇匀，放置0 min、10 min、20 min、40 min、1 h、2 h、3 h后测定其A370值。计算得RSD依次为0.32%、0.27%、0.12%。

1.2.3.8重复性实验 精密称取样A、样B、样C 各50 mg，各5份，置于50 mL容量瓶中，加入无水乙醇40 mL，超声（80 Hz）10 min，取出，放至室温，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，分别取滤液2.0 mL于50 mL容量瓶中，加无水乙醇定容，摇匀，测定A370值，计算得 RSD依次为0.81%、0.73%、0.31%。

1.2.3.9加样回收率实验 精密称取样A、样B、样C溶液各1.0 mL于50 mL容量瓶中，各6份，每份加对照品溶液1.0 mL，加入无水乙醇40 mL溶解，定容，并测定A370值，计算得平均回收率依次为100.3%、97.5%、98.2%，RSD依次为1.98%、2.17%、2.11%。

1.2.4样A、样B、样C含量测定 精密称取样A、样B、样C各50 mg于50 mL容量瓶中，加入无水乙醇40 mL，超声（80 Hz）10 min，取出，放至室温，加溶剂定容至刻度。摇匀，滤过，取续滤液，得1 mg/ mL样A、样B、样C溶液。精密吸取2.0 mL样A、样B、样C溶液于50 mL容量瓶中，定容，摇匀，测定A370值，每个样品测3次，将A370值代入回归方程A= 0.065 1C+0.048 3（r=0.999 2）计算样A、样B、样C质量浓度及含量。

1.2.5α-葡萄糖苷酶抑制活性测定所需溶液的配制1.2.5.1 底物pNPG溶液配制 精密称取11 mg pNPG，加入14.6 mL PBS（pH 6.8）溶解，配制成2.5 mmol/L pNPG溶液，分装，-20℃冻存。

1.2.5.2α-葡萄糖苷酶溶液配制 精密称取0.5 mg冻干酶粉，加入12.5 mL PBS（pH为6.8）溶解，配制成0.4 U/mL酶溶液，分装，-20℃冻存。

1.2.5.31 mg/mL阳性药（阿卡波糖）溶液配制 取1片阿卡波糖（每片含阿卡波糖50 mg），加入50 mL PBS（pH 6.8）溶解，离心，取上清，分装，4℃保存。1.2.5.4 1 mg/mL样品溶液配制 称取样A、样B、样C各10 mg，加入100 μL二甲基亚砜溶解，取10 μL八宝景天总黄酮二甲基亚砜溶液，加入990 μL PBS，得1 mg/mL样品溶液。

1.2.6α-葡萄糖苷酶抑制活性测定 实验分为对照组、空白组、样品组（样A、样B、样C和阿卡波糖）、样品空白组（样A空白、样B空白、样C空白和阿卡波糖空白），各反应物按表1中剂量在96微孔板中进行加样，每组3个平行孔。按表依次加入PBS、样品溶液（样A、样B、样C和阿卡波糖）和底物pNPG，混合均匀，于37℃水浴保温10 min，结束后，取出，加入37℃水浴的酶溶液，充分混匀，于37℃水浴反应30 min。立即在405 nm处测定其A405值，根据公式:抑制率（%）=1-｛［（A对照-A空白）-（A样品-A样品空白）］/（A对照-A空白）｝×100%计算样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率。

表1　试剂、样品加入剂量和顺序

1.3统计学处理 应用SPSS 13.0软件，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1八宝景天总黄酮薄层色谱鉴别 3种样品在槲皮素标准对照品色谱相应位置上均有显示相同颜色的斑点，色谱斑点分离好，显色清晰（图1）。

图1　薄层色谱鉴别

2.2α-葡萄糖苷酶抑制活性测定 各反应物按表1中剂量在96微孔板中进行加样，每组3个平行孔，计算各组A405值（表2）。

表2　α-葡萄糖苷酶抑制活性各组A405值（±s）

表2　α-葡萄糖苷酶抑制活性各组A405值（±s）

组 别　A405值空白组　0.039±0.002对照组　1.295±0.176 样A组　0.844±0.007 样A空白组　0.069±0.011 样B组　0.464±0.013 样B空白组　0.078±0.007 样C组　0.568±0.007 样C空白组　0.081±0.003阿卡波糖组　0.386±0.013阿卡波糖空白组　0.044±0.005

2.3样A、样B、样C含量测定结果和α-葡萄糖苷酶抑制率 3种方法提取得到的八宝景天总黄酮含量依次为（2.80±0.46）%、（5.62±0.56）%、（5.30± 0.62）%（表3），与水提法相比，醇提法和超声法提取得到的总黄酮含量较高（P＜0.05）。取各组A405值的平均值（表2）代入公式计算1 mg/mL样A、样B、样C和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率依次为（38.30±1.54）%、（69.27±6.67）%、（61.23± 5.20）%、（72.77±5.43）%（表3）。样B对α-葡萄糖苷酶抑制率与阿卡波糖比较差异无统计学意义（t= -0.705，P＞0.05），样A、样C对α-葡萄糖苷酶抑制率不及阿卡波糖（t分别为10.59、-2.66，P＜0.05，表3）。

表3　样A、样B、样C含量测定及α-葡萄糖苷酶抑制率（%）

3 讨论

八宝景天俗称八宝、蝎子草、华丽景天、长药景天，为景天科景天属多年生肉质草本植物，以全草入药，终年可采，多鲜用［11-12］，具有祛风利湿、活血散瘀、止血止痛的作用。外用治疗跌打损伤、疔疮肿毒、烫火伤、蜂螯、鸡眼、蛇虫咬伤、手足癣和疱疹，内用治疗吐血、咽喉炎、乳腺炎、荨麻疹［11］。黄酮类物质是八宝景天提取物的主要活性成分之一。作者选取3种较为经典的提取黄酮的方法提取八宝景天总黄酮，建立了96微孔板高通量筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的模型，首次测定了八宝景天总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制活性；结果显示醇提法和超声法提取得到的八宝景天总黄酮含量较水提法含量高，可能是醇提法和超声法所采用的溶剂相同，均是70%的乙醇，所以这2种方法得到的八宝景天总黄酮含量相当。而八宝景天总黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制活性结果显示，醇提法得到的八宝景天总黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制活性最强，与相同含量阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性相当，超声法次之，水提法对酶的抑制活性最差。结合醇提法和超声法得到的八宝景天总黄酮含量测定结果和对α-葡萄糖苷酶抑制活性结果，进一步说明总黄酮含量相同的情况下，对α-葡萄糖苷酶抑制活性不一定相同，可能与提取方法不同，从而得到的总黄酮成分不同有关。

α-葡萄糖苷酶又称α-葡萄糖苷水解酶、麦芽糖酶，它能够从低聚糖类底物的非还原端切开α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖，在机体的多种代谢过程中起着关键的作用，它与许多因代谢紊乱失调而引起的疾病如糖尿病等密切相关［13-14］。在体外适宜条件下，α-葡萄糖苷酶可与pNPG（底物）发生酶解反应，底物pNPG水解后释放出的配基硝基酚显黄色，可在405 nm处测定其A405，从而根据其A405可判断α-葡萄糖苷酶的活性。因而寻找合适的α-葡萄糖苷酶抑制剂将是糖尿病患者控制血糖的一种有效手段。多种药用植物中的黄酮类物质能有效地抑制α-葡萄糖苷酶活性，发挥降血糖的作用［6-8］。本研究醇提法提取的八宝景天总黄酮含量和α-葡萄糖苷酶抑制活性均较高。在今后的研究工作中，作者将进一步对八宝景天总黄酮提取工艺进行优化，以筛选出总黄酮含量高、酶抑制活性强的提取工艺。本研究首次发现，八宝景天总黄酮能显著抑制α-葡萄糖苷酶活性，提示八宝景天总黄酮可能是治疗糖尿病的天然药物，对八宝景天降血糖作用及机制研究有一定的参考价值。

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Extraction of total flavonoids from Sedum spectabile Boreau and its α-glucosidase inhibitory activity

SUN Taoli1，2，XU Xiaohui3，LU Xinhua1
（1.Xiangnan University，Chenzhou Hunan 423000，China；2.Changsha Medical University，Changsha Hunan 410219，China；3.Lanzhou Institute for Food and Drug Inspection，Lanzhou Gansu 730000，China）

R282.71

A

2095-3097（2016）04-0202-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2016.04.003

湘南学院科学研究项目（2014XJ61）

423000湖南郴州，湘南学院（孙陶利，卢新华）；410219湖南长沙，长沙医学院（孙陶利）；730000甘肃兰州，兰州市食品药品检验所（许晓辉）

α-葡萄糖苷酶是水解碳水化合物的关键酶，抑制α-葡萄糖苷酶能延缓碳水化合物的水解，延迟葡萄糖入血，有效地抑制糖尿病患者餐后血糖的升高［1-2］。因此，多种 α-葡萄糖苷酶抑制剂（阿卡波糖）已成功应用于临床治疗糖尿病。这些已经运用于临床的α-葡萄糖苷酶抑制剂大部分属于人工生物或化学合成药物，具有一定的不良反应［3-5］。近年来，通过从药用植物中寻求天然的α-葡萄糖苷酶抑制剂，从而获得高效低毒的药物已经成为治疗糖尿病研究的热点。研究发现，多种药用植物中的黄酮类物质能有效地抑制α-葡萄糖苷酶活性，发挥降血糖的作用［6-8］。八宝景天是景天科景天属多年生肉质草本植物［9-10］，最早在《神农本草经》中有其作为民间药材的记载［10］。《辞海》中提到“全草入药，用以治风湿病、糖尿病”。国内外对其研究主要集中在其生物学特性和景观效应上，对其药用活性研究很少［11］。八宝景天提取物中含有丰富的黄酮类物质，其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用鲜见报道［11-12］。本实验旨在采用3种不同的方法提取八宝景天总黄酮，建立96微孔板高通量筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的模型，测定八宝景天总黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制活性。

（2016-01-19 本文编辑:徐海琴）