高效液相色谱法同时测定黄疸茵陈颗粒中黄芩苷等6种成分含量

杨 丹，朱旭江，徐旭坤，姚世霞，赵建邦

·眼科疾病·

高效液相色谱法同时测定黄疸茵陈颗粒中黄芩苷等6种成分含量

杨 丹，朱旭江，徐旭坤，姚世霞，赵建邦

目的 建立高效液相色谱法同时测定黄疸茵陈颗粒中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、千层纸素A苷6种成分。方法 采用梯度洗脱，色谱柱XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇-0.1%磷酸，流速1.0 mL/min；进样量10 μL；检测波长278 nm；柱温30℃。结果 6种成分在40 min内达到基线分离，6种成分的含量和各自峰面积之间有着良好的线性关系，精密度、重复性及加样回收率的相对标准偏差均小于3.0%。结论 该法快捷、准确，重复性好，能同时测定黄疸茵陈颗粒中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、千层纸素A苷6种成分的含量。

黄疸茵陈颗粒；黄芩苷；黄芩素；高效液相色谱法

［Abstract］Objective To establish high performance liquid chromatography（HPLC）method for the simultaneous determination of baicalin，baicalei，wogonoside，wogonin，oroxylin A and oroxylin A-glucoronide in Huangdan Yinchen Keli by HPLC.Methods HPLC was adopted by using an XB-C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm）with methanol-0.1%phosphoric acid as the mobile phase.The flow rate was 1.0 mL/min and the sample size was 10 μL.The determine wave length was 278 nm and the column temperature was kept at 30℃.Results The six components in Huangdan Yinchen Keli reached baseline separation within 40 minutes.Their relationship between the concentration and the peak areas was linear.The relative standard deviation（RSD）of repeatability，precision and recovery were all less than 3.0%.Conclusion This method is rapid，simple，reliable and it can simultaneously measure the content of baicalin，baicalei，wogonoside，wogonin，and oroxylin A，oroxylin A-glucoronide in Huangdan Yinchen Keli.

［Key words］Huangdan Yinchen Keli；Baicalin；Baicalei；High performance liquid chromatography（HPLC）

黄疸茵陈颗粒是由茵陈、黄芩、大黄、甘草4味中药经提取制成的颗粒制剂，具有清热利湿、祛退黄疸的功效［1］，收载于药品标准中药成方制剂第4册［2］。现行标准仅有化学鉴别项，无含量测定项，为了更有效地控制及综合评价该制剂的质量，作者采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）对黄疸茵陈颗粒中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、千层纸素A苷［3-8］6种成分的含量进行测定。

1 材料与方法

1.1仪器与试药

1.1.1仪器 Waters Alliance e2695型高效液相色谱仪、2998 Dual λ Absorbance Detector和Empower色谱工作站（美国Waters公司），赛多利斯R200D型分析天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］，KH300SP型超声波提取设备（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.1.2试剂与试药 对照品:黄芩苷（批号110715-201117，含量91.7%），汉黄芩苷（含量98.94%），黄芩素（批号111595-200604），汉黄芩素（批号111514-201304），均来源于中国药品生物制品检定所；千层纸素A（批号MUST-15010914，含量98.75%）来源于成都曼斯特生物科技有限公司；千层纸素A苷（含量＞98%）来源于成都瑞芬思生物科技有限公司。样品，黄疸茵陈颗粒分别来自于A、B、C、D 4家药厂）。甲醇为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1色谱条件 色谱柱 XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相甲醇-0.1%磷酸［9-11］。梯度洗脱:0～25 min，40%～60%甲醇；25～30 min，60%～70%甲醇；30～35 min，70%～80%甲醇；35～40 min，80%～60%甲醇；40～45 min，60%～40%甲醇；45～52 min，40%甲醇。流速1.0 mL/min，进样量10 μL，检测波长278 nm［12］，柱温30℃。

1.2.2对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品12.60 mg，加甲醇溶解并稀释至50 mL，制成黄芩苷对照品溶液；精密称取汉黄芩苷对照品10.89 mg，加甲醇溶解并稀释至25 mL，制成汉黄芩苷对照品溶液；精密称取黄芩素对照品9.70 mg，加甲醇溶解并稀释至25 mL，制成黄芩素对照品溶液；精密称取汉黄芩素对照品6.59 mg，加甲醇溶解并稀释至25 mL，制成汉黄芩素对照品溶液；精密称取千层纸素A对照品7.96 mg，加甲醇溶解并稀释至25 mL，制成千层纸素A对照品溶液；精密称取千层纸素A苷对照品4.64 mg，加甲醇溶解并稀释至25 mL，制成千层纸素A苷对照品溶液。分别取上述黄芩苷对照品溶液3 mL，汉黄芩苷对照品溶液1 mL，黄芩素对照品溶液1 mL，汉黄芩素对照品溶液1 mL，千层纸素A对照品溶液1 mL，千层纸素A苷对照品溶液1 mL，置于同一50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得混合对照品溶液。

1.2.3供试品溶液的制备 取本品装量差异项下的内容物，混匀，研细，取1 g，精密称定，置100 mL容量瓶中，加甲醇 70 mL，超声30 min（频率 100 Hz），放冷至室温，加甲醇，稀释至刻度，摇匀，即得［13-16］。

1.2.4阴性样品溶液制备 模拟黄疸茵陈颗粒的工艺制法，自制缺黄芩的阴性样品溶液。

1.2.5线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 μL，按色谱条件，分别进样，测定峰面积。分别以各成分的色谱峰面积为纵坐标（Y），以进样量为横坐标（X），绘制标准曲线，得到黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、千层纸素A苷的回归方程。

1.2.6精密度实验 取混合对照品溶液连续进样6次，每次10 μL，测定，计算各成分峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.2.7稳定性实验 取混合对照品溶液，按色谱条件，分别在0、4、8、12、18、24 h各进样1次，每次10 μL，测定各成分色谱峰峰面积积分值，计算各成分峰面积的RSD。

1.2.8重复性实验 取同一批号黄疸茵陈颗粒样品（批号150401），平行操作制作6份供试品溶液，分别进样，测定其峰面积，计算黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、千层纸素A苷的平均含量（n=6），计算各成分峰面积的RSD。

1.2.9加样回收率实验 精密吸取对照品储备液，黄芩苷2.2 mL、汉黄芩苷0.8 mL、黄芩素0.8 mL、汉黄芩素0.4 mL、千层纸素A 0.4 mL和千层纸素A 苷0.8 mL，采用氮吹仪吹干，再分别精密称取已知含量同一批号的黄疸菌陈颗粒样品（批号150401）0.5 g平行操作6份，制备供试品溶液。分别进样，测定，计算各成分回收率。

1.2.10样品测定 取各批黄疸茵陈颗粒样品，制备供试品溶液，进样，记录峰面积，按外标法计算各样品中各成分的含量。

2 结果

2.1黄疸茵陈颗粒的HPLC色谱图 见图1。

图1　黄疸茵陈颗粒HPLC色谱图

2.2线性关系考察各成分线性回归方程 见表1。

表1　线性方程

2.3精密度与稳定性 黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、千层纸素A苷的精密度与稳定性RSD值分别为0.28%、0.36%、0.72%、0.69%、0.25%、0.81%与 0.55%、0.75%、0.76%、1.15%、0.80%、1.39%。

2.4重复性 黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、千层纸素A苷的平均含量分别为1.758、0.151、0.606、0.458、0.043、0.204 mg/g，其RSD值分别为1.02%、2.16%、1.11%、1.11%、2.13%、1.48%。

2.5加样回收率 各成分回收率见表2。

表2　各成分回收率试验（n=6）

2.6各批黄疸茵陈颗粒样品中6种成分的含量测定 见表3。

表3　各批黄疸茵陈颗粒中6种成分的含量

3 讨论

黄芩作为黄疸茵陈颗粒中的臣药，具有助主药清肝利胆祛湿之效，黄芩主要有效成分为黄酮类化合物包括黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素［17］、黄芩新素、千层纸素A、千层纸素A苷、黄芩黄酮Ⅰ。黄酮类成分具有解热、保肝利胆、镇静、降压降血脂、抗动脉粥样硬化、抗氧自由基损伤功效［18］。汉黄芩苷、黄芩素具有抗菌、抗病毒之效。黄芩苷、汉黄芩素具有抗炎之效。因此，能建立一种方法同时测定黄疸茵陈颗粒制剂黄芩中多种有效成分的含量显得尤为重要。

本实验建立高效液相色谱法同时测定黄疸茵陈颗粒中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、千层纸素A苷6种成分的含量，经方法学验证结果显示，本法精密度良好、稳定性高、重复性好，方法可行；且本法具有操作简便、结果准确的优点，可作为黄疸茵陈颗粒质量的控制指标之一。本法的确立对于全面且综合评价黄疸茵陈颗粒制剂的质量具有重要意义。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版1部［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:85.

［2］中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准［M］.北京:人民卫生出版社，1991:173.

［3］潘鹏飞，孙菲，李延雪.HPLC法同时测定黄芩中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量［J］.中国药师，2012，15（1）: 75-76.

［4］侯学智，张振秋，尤春雪，等.HPLC测定黄芩中6个成分的含量［J］.中国现代应用药学，2012，29（11）:1010-1014.

［5］付延伟，纪松岗，李明春，等.复方茵陈颗粒的质量标准研究［J］.解放军药学学报，2015，31（1）:53-56.

［6］刘金欣，孟繁蕴，张胜海，等.UPLC同时测定黄芩中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、千层纸素A［J］.中草药，2014，45（10）:1477-1480.

［7］王冬梅，高靥，张洪霞，等.HPLC法同时测定芩连片中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的含量［J］.沈阳药科大学学报，2011，28（12）:955-958.

［8］赵亮，王新霞，吕磊，等.HPLC法测定清肝散结颗粒中黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素［J］.中成药，2014，36（2）:313-318.

［9］唐励静，文翔昊，李冲，等.HPLC同时测定复方金银花颗粒中绿原酸、连翘苷、黄芩苷、汉黄芩素、芹菜素的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（21）:71-74.

［10］杨世艳，何兵，张燕.HPLC同时测定银黄颗粒中7种有机酸及4种黄酮类成分［J］.中草药，2013，44（3）:301-304.

［11］周蓬，宋青，马帅.HPLC法同时测定小儿豉翘清热颗粒中栀子苷、芍药苷、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素［J］.中成药，2013，35（8）:1693-1696.

［12］安益强，汤道权，印晓星，等.HPLC法同时测定双黄连颗粒中9种成分［J］.中草药，2012，43（1）:91-93.

［13］徐玲，范志佳，余庆斌，等.HPLC法同时测定肾炎四味胶囊中4种黄酮类成分的含量［J］.中国药师，2015，18 （7）:1133-1135.

［14］周蓬，马帅，张叶，等.HPLC同时测定黄栀花口服液中绿原酸、栀子苷、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2015，21（16）:64-67.

［15］李明，刘斌.中成药复方金银花颗粒中黄芩成分的HPLC法测定［J］.中国药事，2015，29（4）:441-445.

［16］石国明.高效液相色谱法测定黄疸茵陈颗粒中黄芩苷含量［J］.中国药业，2005，14（11）:39.

［17］李春红，梅志强，何兵，等.HPLC同时测定龙胆泻肝制剂中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量［J］.生物学通报，2012，47（4）:60-62.

［18］朱晶晶，王智民，张启伟，等.一测多平法同时测定黄芩药材中4种黄酮类成分的含量［J］.中国中药杂志，2009，34（24）:3229-3234.

Simultaneous determination of six components such as baicalin in Huangdan Yinchen Keli by high performance liquid chromatography

YANG Dan1，ZHU Xujiang2，XU Xukun1，YAO Shixia2，ZHAO Jianbang2
（1.College of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou Ganshu 730000，China；2.Gansu Institute for Drug Control，Lanzhou Ganshu 730070，China）

R282.5

A

2095-3097（2016）04-0206-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2016.04.004

2015年国家药品计划抽验标准完善专题（中成药）第15号

730000甘肃兰州，兰州大学药学院（杨 丹，徐旭坤）；730070甘肃 兰州，甘肃省药品检验研究院（朱旭江，姚世霞，赵建邦）

（2016-04-09 本文编辑:徐海琴）