低纤维饮食联合亚甲蓝肛门注射法建立功能性排便障碍动物模型

李 雪， 耿学斯， 程一乘， 刘 薇， 刘立阳， 刘仍海

1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学东方医院肛肠科；3.北京中医药大学厦门医院肛肠科；4.中日友好医院肛肠科

功能性疾病所致的便秘通常分为正常传输型便秘、慢传输型便秘、排便障碍型便秘、混合型便秘。其中排便障碍型便秘在慢性便秘中最常见，占25%～74%，其特点是直肠排出受阻，表现为直肠推进力不足和(或)排出阻力增加[1]。普遍认为功能性排便障碍(functional defecation disorder，FDD)的发生可能与肠道动力异常、内脏感觉异常、精神心理及社会因素、肠道感染等因素相关。但目前对FDD的生理机制仍不清楚，给临床诊断及治疗带来较大困难。近年来国内外在大鼠、豚鼠、家兔等动物体内利用止泻剂、抗动力剂、泻剂、手术的方法建立了不同类型的便秘模型，在其病理生理研究、药理研究、新药开发等方面取得了较大的进展，但尚缺乏对于FDD动物模型的构建方法。低纤维饮食便秘模型常用于结肠功能失调相关的致便秘机制研究中，亚甲蓝能够阻止神经兴奋传导，对神经末梢具有可逆性麻痹作用，所以本研究尝试利用低纤维饮食联合亚甲蓝肛门注射法构建动物模型，通过对大鼠排便情况、排便功能检测、行为学检测、组织形态学、血清及直肠组织中脑肠肽含量的观察对该模型进行评价，以期模拟一种具有针对性的FDD动物模型，为该疾病进一步的基础研究及临床治疗方法开发提供载体。

1 材料与方法

1.1 实验动物SD雄性大鼠36只，SPF级，8周龄，体质量180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证编号：SCXK(京)2016-0006，饲养于SPF级动物房，温度22～25 ℃，湿度50%～70%，昼夜光照恒定12 h/12 h。动物实验处理均严格遵循动物福利原则及北京中医药大学实验动物伦理委员会的要求。

1.2 实验试剂与仪器亚甲蓝注射液(济川药业集团)；2%利多卡因注射液(哈药集团三精制药公司)。大鼠5-HT、P物质、乙酰胆碱(acetylcholin, Ach)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AchE)ELISA试剂盒均由Solarbio公司提供。EG1150型石蜡包埋仪、RM2235型石蜡切片机、DM3000型正置荧光显微镜、G1150H型均为德国Leica公司产品；loveq-va5型直肠压力测试计(韩国OMOMED公司)。

1.3 动物模型的制备、分组及给药36只SD大鼠适应性饲养3 d后，采用随机数字表法随机分为空白对照组、低纤维饮食组、利多卡因组、亚甲蓝低剂量组、亚甲蓝中剂量组、亚甲蓝高剂量组，每组6只。空白对照组采用普通繁殖饲料饲养，其余各组均采用低纤维饲料饲养；低纤维饮食配方为：41.5%玉米淀粉，24.5%牛奶酪蛋白，10.0%蔗糖，10.0%糊精，7.0%矿物混合物，6.0%玉米油，1%纤维素混合物[由科澳协力饲料有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2014-0010]。各组均自由饮水，饲养第63天，对利多卡因组、亚甲蓝低剂量组、亚甲蓝中剂量组、亚甲蓝高剂量组分别予以2 ml 2%利多卡因、0.05%亚甲蓝注射液、0.1%亚甲蓝注射液、0.2%亚甲蓝注射液(由2%利多卡因溶液配制)，肛周及直肠周围间隙注射1次，实验第77天取材。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 一般行为表现及排便情况：每日观察各组大鼠精神状态、活动情况、进食量、饮水量、毛发光泽程度等情况。记录大鼠24 h粪便总质量。

1.4.2 胃肠传输功能检测：大鼠禁食水12 h，给予各组大鼠10%碳素墨水混悬液2 ml灌服，30 min后以10%水合氯醛0.2 ml/100 mg腹腔注射麻醉，取幽门到直肠末端全部肠道，在松弛状态下测量肠道的全长及碳素墨水混悬液在肠道内推进的长度，并计算碳素墨水混悬液推进长度与肠道全长的比值。碳墨推进比值=墨汁前端到幽门的距离(cm)/肠道总长度(cm)。

1.4.3 排便功能检测：采用模拟球囊排出法和肛管直肠压力测定法检测。分别于实验前及实验后第62天、第69天、第76天测定，测定前需辅助大鼠排尽直肠内粪便，并将大鼠固定。选取直径4～5 mm干黄豆，经石蜡油润滑后将干黄豆置入直肠内2 cm处，记录黄豆排出时间。肛管内置入8 Fr导尿管并与直肠压力测试仪连接，测量大鼠肛管直肠静息压。

1.4.4 行为学检测：于实验第69、76天进行高架十字迷宫实验检测。将实验动物放入迷宫中央区，头朝开臂。同时开启摄像监控器记录5 min内大鼠开臂进入次数(OE)、闭臂进入次数(CE)、开臂滞留时间(OT)、闭臂滞留时间(CT)。开臂进入次数百分比(OE%)=OE/(OE+CE)×100%，开臂滞留时间百分比(OT%)=OT/(OT+CT)×100%。

1.4.5 组织形态学观察：于实验第77天，大鼠经麻醉后脱颈处死，各组大鼠腹主动脉取血后取结肠、直肠组织，一部分固定于10%甲醛溶液中用于制备石蜡切片，另一部分置于-80 ℃冰箱中待用。大鼠组织经常规脱水、包埋、切片、HE染色后，光镜下观察大鼠组织形态学病理学变化并使用IPP 6.0图像分析软件，每个标本选3张切片进行拍照保存。

1.4.6 大鼠外周血中5-HT、P物质、Ach的含量情况：采用ELISA法检测。大鼠取血后，室温静置2 h后，3 000 r/min离心15 min，收集上清液，分装于EP管中，置于-80 ℃冰箱保存；实验时血清样本室温复融，混匀后严格按照5-HT、P物质、Ach试剂盒说明书步骤进行测定。

1.4.7 大鼠直肠组织中CGRP、AchE的含量情况：采用ELISA法检测。各组取6只大鼠，取组织匀浆，严格按照CGRP、AchE试剂盒说明书步骤进行测定。

2 结果

2.1 各组大鼠一般行为表现及排便情况空白对照组实验前后饮水、进食情况良好，毛发光泽良好，精神状态佳，未见精神萎靡或躁动，排便及排尿情况可，无死亡，活动无异常；其余各组大鼠实验后较空白对照组进食量减少，毛发光泽度差，脱毛情况严重，精神状态较差，未见精神躁动，活动量减少；注射后，利多卡因组和亚甲蓝各剂量组较低纤维饮食组大鼠，毛发更为稀疏，且偶有躁动。

如表1所示，实验前各组大鼠粪便呈褐色，粪便质量差异无统计学意义(P>0.05)。实验第62天，空白对照组大鼠粪便质量升高，低纤维饮食组、利多卡因组及亚甲蓝各剂量组粪便呈深褐色，与空白对照组比较，粪便质量降低(P均<0.05)。肛周注射后(实验第69、76天)，与空白对照组比较，低纤维饮食组、利多卡因组及亚甲蓝各剂量组大鼠粪便出现不同程度的变干变硬，低纤维饮食组和利多卡因组粪便呈深褐色，亚甲蓝各剂量组粪便呈黑褐色，粪便质量均明显降低(P<0.05)；与低纤维饮食组比较，利多卡因组粪便性状变化不大，亚甲蓝各剂量组大鼠粪便更为干硬，体积小，但粪便质量差异均无统计学意义(P>0.05)。其中，肛周注射第1周(实验第69天)，亚甲蓝中剂量组粪便质量最低；与低纤维饮食组相比，亚甲蓝中剂量组、亚甲蓝高剂量组在肛周注射后粪便质量减轻，但差异无统计学意义(P>0.05)；与利多卡因组比较，亚甲蓝各剂量组大鼠粪便质量均降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠粪便质量Tab 1 Stool weight of rats in each group g)

2.2 各组大鼠胃肠传输功能情况各组大鼠碳墨推进比值相比，差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 各组大鼠碳墨推进比值Tab 2 Carbon-ink propulsion ratio in each group

2.3 各组大鼠排便功能变化情况

2.3.1 各组大鼠模拟球囊排出情况：如表3所示，肛周注射前各组大鼠黄豆排出时间差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组相比，肛周注射1周，利多卡因组和亚甲蓝各剂量组黄豆排出时间增加(P<0.05)，而低纤维饮食组无显著变化；肛周注射第2周，低纤维饮食组仍无显著变化，利多卡因组和亚甲蓝各剂量组黄豆排出时间增加，但较注射1周时略有减少。与低纤维饮食组比较，肛周注射后，利多卡因组及亚甲蓝各剂量组排出时间均有不同程度的增加，但只有亚甲蓝各剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。与利多卡因组比较，肛周注射1周，亚甲蓝各剂量组排出时间增加，但差异无统计学意义(P>0.05)；肛周注射2周，亚甲蓝各剂量组排出时间增加，亚甲蓝中剂量组和亚甲蓝高剂量组与利多卡因组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组大鼠模拟球囊排出时间Tab 3 Simulated balloon expulsion time of rats in each group s)

2.3.2 各组大鼠肛管直肠静息压情况：如表4所示，肛周注射前，各组大鼠肛管静息压无显著变化。与空白对照组比较，肛周注射后，低纤维饮食组无显著变化，利多卡因组及亚甲蓝各剂量组肛管静息压下降(P<0.05)，但注射2周较注射1周肛管静息压略有回升。肛周注射后，与低纤维饮食组比较，利多卡因组及亚甲蓝各剂量组肛管静息压均有不同程度下降(P<0.05)。与利多卡因组对比，肛周注射后，亚甲蓝各剂量组肛管静息压降低(P<0.05),其中亚甲蓝中剂量组在注射1周后肛管直肠静息压最低。

表4 各组大鼠肛管直肠静息压情况Tab 4 Comparison of the resting pressure of anorectal canal of rats in each group cmH2O)

2.4 各组大鼠行为学变化情况如表5所示，与空白对照组比较，肛周注射后，低纤维饮食组大鼠OT%和OE%差异无统计学意义(P>0.05)，利多卡因组及亚甲蓝各剂量组OT%、OE%均显著下降(P<0.01)。与低纤维饮食组比较，肛周注射后，利多卡因组及亚甲蓝各剂量组OT%、OE%下降(P<0.05)。与利多卡因组对比，肛周注射后，亚甲蓝各剂量组OT%及OE%差异无统计学意义(P>0.05)。

表5 各组大鼠高架十字迷宫检测情况Tab 5 Elevated plus-maze test of rats in each %)

2.5 各组大鼠组织病理结果如图1～2所示，空白对照组：结、直肠组织中腺体排列整齐，结构完整，未见明显充血、水肿，无明显炎性细胞浸润；低纤维饮食组：腺体排列欠整齐，固有层及黏膜下层出现少量的炎性浸润；利多卡因组：固有层有少量炎性细胞外，黏膜肌层和黏膜下层均存在大量炎性浸润，且伴有明显的血管扩张充血；亚甲蓝低剂量组：固有层可见大量的炎性细胞浸润，黏膜下层可见血管扩张；亚甲蓝中剂量组：固有层可见少量炎性细胞，黏膜肌层及下层则见大量炎性细胞浸润，血管扩张；亚甲蓝高剂量组：黏膜下层出现大量的淋巴细胞浸润，并伴血管扩张。

注：A:空白对照组；B:低纤维饮食组；C:利多卡因组；D:亚甲蓝低剂量组；E:亚甲蓝中剂量组；F:亚甲蓝高剂量组。图1 各组大鼠结肠组织学变化(HE染色，100×)Fig 1 Histological changes of rats colon tissue in each group (HE staining, 100×)

注：A:空白对照组；B:低纤维饮食组；C:利多卡因组；D:亚甲蓝低剂量组；E:亚甲蓝中剂量组；F:亚甲蓝高剂量组。图2 各组大鼠直肠组织学变化(HE染色，100×)Fig 2 Histological changes of rats rectal tissue in each group (HE staining, 100×)

2.6 各组大鼠血清脑肠肽的含量情况如表6所示，与空白对照组对比，低纤维饮食组、利多卡因组、亚甲蓝各剂量组大鼠血清5-HT含量水平明显降低(P<0.05)，其中亚甲蓝中剂量组下降最多；与低纤维饮食组对比，利多卡因组及亚甲蓝各剂量组含量水平均降低(P<0.05)；与利多卡因组对比，亚甲蓝低剂量组含量水平略有回升，差异有统计学意义(P<0.05)，亚甲蓝中剂量组、亚甲蓝高剂量组含量水平下降(P<0.05)。与空白对照组对比，低纤维饮食组、利多卡因组及亚甲蓝各剂量组大鼠血清P物质含量水平均有不同程度的降低，其中只有亚甲蓝中剂量组、亚甲蓝高剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，亚甲蓝中剂量组下降最多；与低纤维饮食组对比，利多卡因组及亚甲蓝低剂量组含量水平差异无统计学意义(P>0.05)，亚甲蓝中剂量组、亚甲蓝高剂量组含量水平降低(P<0.05)；与利多卡因组对比，亚甲蓝各剂量组含量水平均有下降，其中亚甲蓝中剂量组、亚甲蓝低剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组对比，低纤维饮食组、利多卡因组及亚甲蓝各剂量组大鼠血清Ach含量水平均有不同程度的降低，其中只有亚甲蓝各剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，且亚甲蓝中剂量组下降最多；与低纤维饮食组对比，亚甲蓝各剂量组含量水平降低(P<0.05)，利多卡因组差异无统计学意义(P>0.05)；与利多卡因组对比，亚甲蓝各剂量组含量水平均有下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

表6 各组大鼠血清脑肠肽的含量情况Tab 6 Brain-gut peptide contents in serum of rats in each group pg/ml)

2.7 各组大鼠直肠组织中CGRP、AchE的含量情况

如表7所示，与空白对照组对比，低纤维饮食组、利多卡因组及亚甲蓝各剂量组大鼠直肠组织中CGRP含量升高，AchE含量下降。其中，亚甲蓝各剂量组CGRP含量较空白对照组升高(P<0.05)；利多卡因组及亚甲蓝各剂量组AchE含量较空白对照组降低(P<0.05)；与低纤维饮食组对比，亚甲蓝中剂量组CGRP含量升高，AchE含量降低(P<0.05)；与利多卡因组对比，亚甲蓝中剂量组、亚甲蓝高剂量组CGRP含量升高(P<0.05)，亚甲蓝中剂量组AchE含量较利多卡因组降低(P<0.05)。

表7 各组大鼠直肠组织中CGRP、AchE含量情况Tab 7 Contents of CGRP and AchE in rats rectal tissue in each group pg/ml)

3 讨论

FDD是一类以功能型便秘(长期的排便困难、排便不畅、排便次数减少、粪便干结及量少)为主要临床表现，伴见矛盾的肛门收缩、不完全肛门松弛、直肠推力不足或低敏感性的功能性疾病。其诊断标准需满足便秘及特征性排便功能下降的条件。目前便秘的造模方法多样，以往模拟慢传输型便秘、便秘型肠易激综合征、泻药性便秘的动物模型在基础研究中得到了广泛应用，然而尚无公认的FDD动物模型[2]。国内研究中，有研究通过使用直肠缩窄法构建出口梗阻型便秘模型的报道，但出口梗阻型便秘并不能完全解释FDD[3]。低纤维饮食便秘模型能够模拟人类不良饮食习惯引起的非病理性因素便秘，由于该造模方法不但简单易行，且能够避免药物对大鼠产生的一系列的不良反应，常被用于结肠功能失衡相关的便秘机制研究[4]。实验中我们发现，低纤维饮食大鼠在实验开始1周后，1/3大鼠开始出现粪便干结、变细，颜色变深，实验第4周，半数大鼠粪便出现干结，实验第8周后，各组大鼠粪便干结，呈深褐色，粪便质量明显低于空白对照组，体质量增长速度明显减慢。其结、直肠组织形态学及血清5-HT的含量水平也与功能型便秘更为贴近，但排便功能、行为学方面与空白对照组大鼠差异均无统计学意义[5]。

《罗马Ⅳ》中认为排便功能的异常主要包括不协调排便或排便推进力不足。不协调排便主要指大脑在接受排便指令后调节神经肌肉，使肛提肌、肛门括约肌等排便肌肉在有规律的松弛或紧张的过程中，出现肌肉矛盾运动；排便推进力不足主要指控制排便的肌群在接受排便指令后能够松弛，但无法维持足够排便压，无力将大便排出，同时也可伴见直肠静息压下降等表现[6]。在构建大鼠FDD模型的过程中，由于控制排便的肌肉和神经涉及多个肌群，且大鼠肛门括约肌薄弱，构建多肌群矛盾运动较为困难。由于大鼠直肠压力主要由肛门括约肌维持，我们认为对大鼠肛门括约肌周围神经进行缓慢阻滞可以降低直肠压力，从而模拟排便推进力不足。利多卡因是短效、局部麻醉药，具有较好的镇痛作用，实验中我们发现，尽管局部肛周注射利多卡因，与低纤维饮食组大鼠对比，其粪便重量、排便功能、行为学及血清、直肠中脑肠肽含量差异无统计学意义，但大鼠的配合度较高，注射后无明显弓背、狂躁等表现。亚甲蓝是一种吩噻嗪盐，具有亲神经性，其肛周皮肤及括约肌注射后可以缓慢麻痹肛门括约肌，不至于瞬间麻痹排便肌肉而导致失禁；且作为可逆性神经肌肉阻滞剂，正常剂量不会对肛门括约肌造成永久性损伤，与FDD盆底肌功能障碍的可习得、可治愈的生理表现相似[7]。因此，我们将亚甲蓝与2%利多卡因配比稀释进行大鼠肛周注射。注射后，相对于低纤维饮食组，粪便质量及结、直肠组织形态学方面并无明显的改变，但出现了排便功能的异常(球囊排出时间延长、直肠静息压力下降)，这些与临床实验中的结果具有一致性[8]。

肠神经系统、肠神经递质的紊乱可能引起严重的便秘，便秘患者常表现出脑肠肽表达水平的下调[5，9-10]。因此，除了排便功能及行为学的检测，我们对大鼠血清及直肠中脑肠肽含量进行检测，发现大鼠在注射亚甲蓝前除5-HT外，均无明显变化，注射亚甲蓝后，亚甲蓝各剂量组血清及直肠脑肠肽含量与低纤维饮食组相比,差异有统计学意义，其中亚甲蓝中剂量组最为显著，提示大鼠注射亚甲蓝后存在肠神经调节的紊乱。此外，我们也检测了各组大鼠胃肠传输情况，发现各组大鼠结肠碳墨推进比值差异均无统计学意义，提示该模型对胃肠动力未有改变，这与《罗马Ⅳ》及《中国慢性便秘专家共识意见(2019，广州)》对于FDD的诊断标准一致[6，11]。综上，低纤维饮食联合亚甲蓝肛周注射法从粪便性状、肛门动力学、行为学方面能够较好地模拟FDD发病情况，操作简便，可重复性较高，可以作为FDD的动物模型，进行进一步的基础研究。