促进PPAR-γ表达对TGF-β1诱导人胰腺癌BxPc-3细胞上皮-间质转化的影响

李 博， 施景龙， 魏海雄， 邱厚匡， 许 鸣

1.广东省第二人民医院消化内科，广东 广州 510317； 2.广州市第十二人民医院普外科； 3.深圳市坪山区疾病预防控制中心

侵袭和转移是胰腺癌的重要特征，也是造成胰腺癌患者死亡的重要原因[1]。肿瘤细胞发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的直接后果包括细胞粘附能力下降，穿破基底膜进入血液循环、逃避免疫监视及在远隔部位生长等。近年来对过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPAR-γ)与胰腺癌侵袭转移现象的关注逐渐增多，但尚无PPAR-γ在胰腺癌EMT过程中作用的研究。本研究中我们采用TGF-β1诱导人胰腺癌细胞株BxPc-3建立EMT模型，通过观察其在PPAR-γ激动剂罗格列酮作用下BxPc-3形态学、侵袭性改变，及EMT相关标记分子的检测，明确PPAR-γ是否参与人胰腺癌BxPc-3细胞EMT过程中的调节。为进一步研究抑制胰腺癌EMT寻找新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料BxPc-3细胞购自上海中科院细胞研究所；TGF-β1购自Propertech公司；PPAR-γ激动剂罗格列酮购自Sigma公司；胰酶、高糖DMEM培养基购自Gibco公司；Transwell小室购自Coming公司；Matrigel生物胶购自BD公司；鼠抗人PPAR-γ单克隆抗体、N-钙黏蛋白(N-cadherin)单克隆抗体、鼠抗人波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体、鼠抗人N-cadherin单克隆抗体、内参磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)购自南京凯基公司。

1.2 细胞培养人类胰腺癌细胞系BxPc-3细胞用含质量浓度为100 mg/L的胎牛血清的DMEM培养液于37 ℃，体积分数为5%的CO2培养箱中培养，细胞均呈贴壁生长。每2～3 d用质量浓度为2.5 g/L胰酶消化传代1次。

1.3 实验分组共分6组：A：TGF-β1组；B：TGF-β1+5 μmol/L罗格列酮组；C：TGF-β1+10 μmol/L罗格列酮组；D：TGF-β1+20 μmol/L罗格列酮组；E：TGF-β1+40 μmol/L罗格列酮组；F：对照组。TGF-β1组细胞给予10 ng/ml TGF-β1处理，其余各组在TGF-β1诱导前2 h加入相应终浓度为5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的PPAR-γ激动剂罗格列酮，对照组使用含有0.1% DMSO的细胞培养液。各组细胞培养96 h后进行相应检测。

1.4 细胞形态学观察倒置显微镜下观察细胞形态学变化。

1.5 Transwell-matrigel体外侵袭实验Matrigel胶与无血清培养液按1∶3比例稀释，取50 μl铺于Transwell上室中，用无血清培养液重悬BxPc-3细胞并种入Transwell上室中，下室中加入完全培养基，加入相应实验药物处理，于37 ℃培养箱中培养96 h取出Transwell小室，用棉棒擦净聚碳酸滤膜上的Matrigel胶，得到小室下面的聚碳酸滤膜，将聚碳酸滤膜以戊二醛固定，结晶紫染色。在显微镜中(200倍视野)计数，任取5个视野，计算每1 mm2内的细胞数取其平均值，以该平均数作为评价癌细胞侵袭性的指标。

1.6 Western blotting检测收集各组细胞，加入600 μl RIPA细胞裂解液，离心30 min(离心率为3 000 r/min)，上清即为总的细胞蛋白溶解成分。上清液加等量2倍SDS上样缓冲液在SDS-PAGE凝胶上电泳，然后电转膜到醋酸纤维膜上，用质量浓度为50 g/L脱脂奶粉封闭，分别加入相应一抗(PPAR-γ、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)抗体，终质量浓度均为1∶100，4 ℃孵育过夜，TBS洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1∶10 000)37 ℃孵育2 h，常规洗膜3次，增强化学发光(ECL)荧光显色系统检测，X线片感光显影，AlphaImager 2200图像系统分析其灰度值。

2 结果

2.1 TGF-β1对BxPc-3细胞侵袭性的影响TGF-β1组与对照组相比，其细胞形态逐渐变化为长梭形，且细胞的移动表现的更有活力，能单个活动，出现组织间极性下降的倾向，出现EMT的特征性形态学改变(见图1A～1B)；TGF-β1组穿膜细胞数(103.9±4.098)较对照组(80.509±3.598)高，差异有统计学意义(P<0.05)，符合BxPc-3经诱导EMT后侵袭性增强的特点(见图1C～1D)。

图1 TGF-β1对BxPc-3细胞形态及侵袭性的影响(200×) A：对照组；B：TGF-β1组；C：TGF-β1组；D：对照组Fig 1 The effect of TGF-β1 on the morphology and invasiveness of BxPc-3 cells (200×) A: control group; B: TGF-β1 group;C: TGF-β1 group; D: control group

2.2 TGF-β1对BxPc-3细胞中EMT相关因子的影响TGF-β1组细胞间质标记基因Vimentin、N-cadherin蛋白表达与对照组相比均明显升高(P<0.05)，上皮标记基因E-cadherin蛋白表达较对照组下降(P<0.05)(见图2)。

注：与对照组相比，*P<0.05。图2 TGF-β1对BxPc-3细胞中EMT相关因子的影响 Fig 2 Effect of TGF-β1 on EMT related factors in BXPC-3 cells

2.3 促进PPAR-γ表达对TGF-β1诱导人胰腺癌BxPc-3细胞EMT过程细胞侵袭性的影响于倒置显微镜中(200倍视野)观察计数，TGF-β1+20 μmol/L罗格列酮组穿膜细胞(92.6±5.096)个/mm2，TGF-β1+40 μmol/L罗格列酮组穿膜细胞(85.9±2.096)个/mm2，显著低于TGF-β1组(103.9±4.098)个/mm2(P<0.05)，而TGF-β1+5 μmol/L罗格列酮组穿膜细胞(99.2±4.077)个/mm2，与TGF-β1+10 μmol/L罗格列酮组穿膜细胞(97.9±5.086)个/mm2、TGF-β1组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。表明给予20 μmol/L、40 μmol/L罗格列酮促进PPAR-γ表达可降低BxPc-3细胞EMT过程细胞侵袭性(见图3)。

图3 各组BxPc-3细胞侵袭性(200×) A：TGF-β1组；B：TGF-β1+5 μmol/L罗格列酮组；C：TGF-β1+10 μmol/L罗格列酮组；D：TGF-β1+20 μmol/L罗格列酮组；E：TGF-β1+40 μmol/L罗格列酮组；F：对照组Fig 3 Invasiveness of BxPc-3 cells among each group (200×) A: TGF-β1 group; B: TGF-β1+5 μmol/L Rosiglitazone group;C: TGF-β1+10 μmol/L Rosiglitazone group; D: TGF-β1+20 μmol/L Rosiglitazone group; E: TGF-β1+40 μmol/L Rosiglitazone group;F: control group

2.4 促进PPAR-γ表达对TGF-β1诱导人胰腺癌BxPc-3细胞EMT过程中相关因子的影响BxPc-3细胞经TGF-β1作用后PPAR-γ表达明显下降(P<0.05)，而TGF-β1+20 μmol/L、TGF-β1+40 μmol/L罗格列酮组细胞PPAR-γ表达较TGF-β1组逐渐升高(P<0.05)；TGF-β1+20 μmol/L、TGF-β1+40 μmol/L罗格列酮组细胞组上皮标记基因E-cadherin蛋白表达较TGF-β1组逐渐升高(P<0.05)；TGF-β1+20 μmol/L、TGF-β1+40 μmol/L罗格列酮组细胞间质标记基因Vimentin、N-cadherin蛋白表达与TGF-β1组相比均明显降低(P<0.05)，而前两组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见图4)。

注：与对照组比较，*P<0.05；与TGF-β1组比较，#P<0.05；与TGF-β1+20 μmol/L罗格列酮组比较，△P<0.05。图4 各组BxPc-3细胞EMT相关因子的表达 A：TGF-β1组；B：TGF-β1+20 μmol/L罗格列酮组；C：TGF-β1+40 μmol/L罗格列酮组；D：对照组Fig 4 Expressions of EMT related factors in BxPc-3 cells A: TGF-β1 group; B: TGF-β1+20 μmol/L Rosiglitazone group;C: TGF-β1+40 μmol/L Rosiglitazone group; D: control group

3 讨论

胰腺癌由于其侵袭性强，早期常已浸润大血管、神经等，造成手术切除难度大，总体5年生存率不足1%[1]。因此，在胰腺癌患者中肿瘤早期的浸润及转移是造成患者生存率低下的元凶[2]。近年来发现，EMT在胰腺癌的侵袭转移、耐药等过程中起着重要的作用[3-4]。Yin等[5]将Snail cDNA转染Panc-1细胞后，Panc-1细胞在发生EMT的同时，其浸润能力明显增加。然后将发生EMT的Panc-1细胞接种到裸鼠胰腺，1个月后发现所有的裸鼠均有淋巴结转移，且2/3发生肝转移。Shintani等[6]和von Burstin等[7]更进一步证实胰腺癌侵袭性和肺部转移分别与胰腺癌中的N-cadherin的高表达与E-cadherin基因的失活相关，而这种黏附素转变被认为是EMT的典型特征。

TGF-β1在肿瘤发生发展及纤维化过程中被证实为EMT的主要诱导剂[8]。本研究中，BxPc-3细胞呈典型的上皮细胞形态，经TGF-β1处理后，细胞由原来的圆形片团状生长变化为长梭形，并且表现出细胞间连接减弱，表现出间质细胞形态特征。随后的Transwell-matrigel侵袭实验结果显示，经TGF-β1处理后BxPc-3细胞更加具有侵袭性，符合BxPc-3经诱导EMT后侵袭性增强的特点。

EMT的发生除细胞形态学变化外，更重要的指标是其相关标记蛋白的变化。上皮标记蛋白E-cadherin是一种跨膜蛋白，其丢失使得上皮细胞极性消失，导致相邻细胞间连接疏松，其表达降低或丢失是EMT最重要的标志性变化[9]。N-cadherin、Vimentin均是间质细胞来源的骨架蛋白，这类蛋白增多使得上皮源性细胞具有成纤维细胞特征，更易于迁移及粘附[10]。因此，上皮标记蛋白E-cadherin表达降低，间质标记蛋白Vimentin、N-cadherin等表达升高被认为是EMT发生的重要标志。本实验结果显示，TGF-β1作用BxPc-3细胞后导致E-cadherin蛋白表达下降，而间质标记基因Vimentin、N-cadherin蛋白表达升高，验证了TGF-β1诱导BxPc-3细胞EMT模型的建立。

PPAR是一类由配体激活的转录因子，属于Ⅱ型核激素受体超家族成员，由英国科学家Issemann 等[11]于1990年首先发现。它包含PPAR-α、PPAR-β、PPAR-γ三种亚型，分别由不同基因编码，在结构和功能上存在一定差异。近年来发现PPAR-γ具有抗肿瘤效应，参与多种肿瘤发生发展的过程，已经成为近年来研究的热点。激活PPAR-γ基因不仅可以促使肝细胞癌细胞周期停滞，而且还可以促进肝细胞癌细胞凋亡[12-13]。Eibl等[14]研究认为，PPAR-γ能诱导胰腺癌细胞凋亡，阻止细胞生长，半胱天冬酶-3能够独立诱导细胞凋亡。曲格列酮可能通过PPAR-γ信号通路，破坏谷氨酰胺的新陈代谢，从而起到抗肺癌(H460细胞)细胞活性的作用[15]。通过观察PPAR-γ激动剂吡格列酮对人胃癌SGC7901细胞株体外生长的影响，认为吡格列酮可能通过上调PPAR-γ的表达，从而以剂量和时间依赖的方式抑制TGF-β1诱导的人胃癌SGC7901细胞的生长，并促进其凋亡[16]。

我们实验结果表明，TGF-β1+5 μmol/L、TGF-β1+10 μmol/L罗格列酮组BxPc-3细胞侵袭性与TGF-β1组相比差异无统计学意义，而TGF-β1+20 μmol/L、TGF-β1+40 μmol/L罗格列酮组可降低BxPc-3细胞EMT过程细胞侵袭性。Western blotting检测结果提示，BxPc-3细胞经TGF-β1作用，其可显著抑制PPAR-γ的表达，而TGF-β1+20 μmol/L、TGF-β1+40 μmol/L组细胞PPAR-γ表达逐渐升高；TGF-β1+20 μmol/L、TGF-β1+40 μmol/L组细胞间质标记基因Vimentin、N-cadherin蛋白表达与TGF-β1组相比均明显降低，而E-cadherin蛋白表达升高。结果表明，TGF-β1可诱导BxPc-3细胞EMT过程，而这一作用可被PPAR-γ激动剂罗格列酮所阻断。

因此，我们认为促进PPAR-γ表达可以有效抑制人胰腺癌BxPc-3细胞EMT过程及侵袭性。我们的实验为进一步研究抑制胰腺癌EMT提供了新的靶点。而探索PPAR-γ参与人胰腺癌BxPc-3细胞EMT过程中的信号传导通路是我们下一步的研究方向。