miR-19a靶向PTEN调控肝癌细胞增殖、凋亡的实验研究

赵海清， 覃玉梅， 黄玉斌， 汪江波

广西壮族自治区南溪山医院药学部，广西 桂林 541001

肝癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤，恶性程度高、预后差、5年生存率低[1-3]。目前，肝癌的发病机制未完全阐明，临床上也缺乏相应的靶向治疗手段。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是近年来发现具有广泛生物学作用的非编码小分子RNA，在转录后水平调节多种基因的表达，在恶性肿瘤的发生发展中起到促癌或抑癌作用。王红芳等的研究表明，肝癌组织中miR-19a的表达增多、抑癌基因第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)的表达减少且miR-19a与PTEN呈负相关[4]；经生物信息学分析，PTEN基因mRNA的3’非编码区(3’UTR)上有miR-19a的结合位点，以上分析提示miR-19a可能参与肝癌的发生发展且靶向抑癌基因PTEN是可能的miR-19a参与肝癌发生发展的机制。为了明确miR-19a在肝癌发生中的作用及可能机制，本实验将在肝癌细胞株HepG2中研究miR-19a靶向PTEN调控细胞增殖、凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：肝细胞癌细胞株HepG2、人正常肝细胞株HL-7702购自中科院上海细胞资源中心。

1.1.2 试剂：miR-19a mimic及阴性对照(NC)mimic由上海吉玛公司合成，表达PTEN的GV273质粒、空白的GV273质粒由上海吉凯公司合成，MTS细胞增殖检测试剂盒购自美国Biovision公司(货号：K300-500)，TUNEL凋亡检测试剂盒购自上海碧云天公司(货号：C1086)，兔来源PTEN的多克隆抗体购自美国Abcam公司(货号：ab170941)。

1.1.3 仪器：荧光定量PCR仪为美国ABI公司(型号ABI7500)，显微镜为日本Nikon公司(型号T2R)，凝胶成像系统为上海天能公司(型号1600R)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组、转染：HepG2细胞和HL-7702细胞均在质量浓度为100 g/L的胎牛血清的DMEM中培养，质量浓度为2.5 g/L胰蛋白酶消化后传代，HL-7702细胞直接用于miR-19a、PTEN表达的检测，HepG2细胞进行分组，方法如下：(1)NC组：转染NC mimic；(2)miR-19a组：转染miR-19a mimic；(3)NC质粒组：转染空白的GV273质粒；(4)NC质粒+miR-19a组：转染空白的GV273质粒及miR-19a mimic；(5)PTEN质粒+miR-19a组：转染表达PTEN的GV273质粒及miR-19a mimic。转染均用转染试剂Lipofectamine 3000进行，按照试剂说明书进行转染操作。

1.2.2 细胞增殖检测：HepG2细胞接种在96孔培养板中，分组转染后24 h，按MTS试剂盒进行检测，在酶标仪上读取490 nm波长的吸光值OD490。

1.2.3 细胞凋亡检测：HepG2细胞接种在24孔培养板中，分组转染后24 h，按TUNEL试剂盒进行检测，在显微镜下观察TUNEL阳性染色的细胞及DAPI阳性染色的细胞并计数，而后计算细胞凋亡率。

1.2.4 miR-19a表达检测：HepG2细胞接种在12孔培养板中，分组转染后24 h，按miRNA提取试剂盒进行操作，分离细胞中的miRNA，按miRNA cDNA第一链合成试剂盒进行操作，将miRNA反转录为cDNA，按miRNA荧光定量PCR检测试剂盒配置反应体系，cDNA 1 μl、反应预混液10 μl、5 μmol/L的上游引物0.6 μl、5 μmol/L的下游引物0.6 μl、去离子水7.8 μl，混匀后在荧光定量PCR仪上按照95 ℃预变性3 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 34 s的程序反应40个循环，自动生成循环曲线及阈值，以U6为内参，计算miR-19a的表达量。

1.2.5 PTEN表达检测：HepG2细胞接种在12孔培养板中，分组转染后24 h，按RIPA裂解液进行操作，裂解细胞并提取蛋白，检测蛋白含量后取30 μg蛋白进行Western blotting检测，将蛋白样本加入SDS-PAGE后进行电泳，而后电转移至NC膜，用质量浓度为50 g/L的脱脂牛奶在室温封闭NC膜1 h，用1∶1 000稀释的PTEN抗体或1∶5 000稀释的β-actin抗体在4 ℃孵育NC膜过夜。次日，用1∶2 000稀释的二抗在室温孵育NC膜1 h，最后在凝胶成像系统显影中得到蛋白条带，根据条带的灰度值，以β-actin为内参计算PTEN的蛋白表达量。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测：根据Targetscan预测PTEN基因mRNA 3’UTR上miR-19a的结合位点，构建含有野生型3’UTR序列的双荧光素酶报告基因，将miR-19a的结合位点突变后构建含有突变型3’UTR序列的双荧光素酶报告基因，将荧光素酶报告基因与miR-19a mimic或NC mimic共转染HepG2细胞，24 h后用质量浓度为2.5 g/L胰蛋白酶消化、3000转/min离心10 min收集细胞，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒分别检测萤火虫荧光值和海肾荧光值，以萤火虫荧光值/海肾荧光值计算荧光素酶报告基因的荧光活性。

1.3 统计学处理采用SPSS 23.0统计学软件进行分析，两组间计量资料的比较采用t检验，多组间计量资料的比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HepG2细胞与HL-7702细胞中miR-19a、PTEN表达的比较HepG2细胞中miR-19a的表达水平高于HL-7702细胞，PTEN的表达水平低于HL-7702细胞，差异有统计学意义(P<0.05)(见图1)。

注：与HL-7702细胞比较，*P<0.05。图1 HepG2细胞和HL-7702细胞中miR-19a、PTEN表达的比较 A：qRT-PCR检测miR-19a表达；B～C：Western blotting检测PTEN表达Fig 1 Comparison of miR-19a and PTEN expressions in HepG2 cells and HL-7702 cells A: detection of miR-19a expression by qRT-PCR; B-C: the expression of PTEN detected by Western blotting

2.2 miR-19a对HepG2细胞增殖、凋亡的调节miR-19a组HepG2细胞中miR-19a的表达水平高于NC组(P<0.05)(见图2A)，增殖活力OD490水平高于NC组(P<0.05)(见图2B)，凋亡率低于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)(见图2C～2D)。

注：与NC组比较，*P<0.05。图2 miR-19a调节HepG2细胞的增殖及凋亡 A：qRT-PCR检测miR-19a表达；B：MTS法检测细胞增殖；C～D：TUNEL法检测细胞凋亡Fig 2 miR-19a regulates proliferation and apoptosis of HepG2 cells A: detection of miR-19a expression by qRT-PCR;B: cell proliferation detected by MTS; C-D: apoptosis detected by TUNEL method

2.3 miR-19a对HepG2细胞中PTEN的靶向调节miR-19a组HepG2细胞中PTEN的表达水平低于NC组(P<0.05)(见图3A～3B)；PTEN基因mRNA 3’UTR含有miR-19a的结合靶点(见图3C)；miR-19a组HepG2细胞中含有野生型PTEN基因mRNA 3’UTR的荧光素酶报告基因活力低于NC组(P<0.05)(见图3D)，突变型PTEN基因mRNA 3’UTR的荧光素酶报告基因活力与NC组比较，差异无统计学意义(P<0.05)(见图3E)。

注：与NC组比较，*P<0.05。图3 miR-19a靶向调节HepG2细胞中的PTEN基因 A～B：Western blotting检测PTEN表达；C：Targetscan网站预测PTEN基因mRNA 3’UTR中miR-19a的结合位点；D：含有野生型PTEN基因mRNA 3’UTR荧光素酶报告基因的荧光活力；E：含有突变型PTEN基因mRNA 3’UTR荧光素酶报告基因的荧光活力Fig 3 miR-19a targeted regulates PTEN gene in HepG2 cells A-B: the expression of PTEN detected by Western blotting; C: Targetscan site predicted miR-19a binding site in 3’UTR of PTEN mRNA; D: fluorescence activity of Luciferase reporter gene containing wild-type PTEN mRNA 3’UTR; E: fluorescence activity of Luciferase reporter gene containing mutant PTEN mRNA 3’UTR

2.4 过表达PTEN对miR-19a调节HepG2细胞增殖、凋亡的影响NC质粒+miR-19a组HepG2细胞中PTEN的表达水平低于NC质粒组，PTEN质粒+miR-19a组HepG2细胞中PTEN的表达水平高于NC质粒+miR-19a组(P<0.05)(见图4A～4B)；NC质粒+miR-19a组HepG2细胞的增殖活力OD490水平高于NC质粒组，PTEN质粒+miR-19a组HepG2细胞增殖活力OD490水平低于NC质粒+miR-19a组(P<0.05)(见图4C)；NC质粒+miR-19a组HepG2细胞的凋亡率低于NC质粒组，PTEN质粒+miR-19a组HepG2细胞的凋亡率高于NC质粒+miR-19a组(P<0.05)(见图4D～4E)。

注：与NC质粒组比较，*P<0.05；与NC质粒+miR-19a组比较，#P<0.05。图4 过表达PTEN对miR-19a调节HepG2细胞增殖、凋亡的影响 A～B：Western blotting检测PTEN表达；C：MTS法检测细胞增殖；D～E：TUNEL法检测细胞凋亡 Fig 4 Effects of overexpression of PTEN on mir-19a regulating proliferation and apoptosis of HepG2 cells A-B: the expression of PTEN detected by Western blotting; C: cell proliferation detected by MTS; D-E: apoptosis detected by TUNEL method

3 讨论

miRNAs是一类在转录后水平调节基因表达的非编码小分子RNA，近年来miRNAs的异常表达被证实与多种恶性肿瘤的发生有关。在结直肠癌、非小细胞肺癌、前列腺癌等恶性肿瘤组织中，miR-19a均呈高表达趋势[5-7]；另有研究表明，miR-19a在肝癌组织中表达增多且与肝癌的病理特征、临床预后均相关[8-9]。本实验在上述临床研究的基础上，进一步比较了肝癌细胞株HepG2及正常肝细胞HL-7702中miR-19a表达的差异，结果显示：HepG2细胞中miR-19a的表达水平明显高于HL-7702细胞，与miR-19a在肝癌组织中表达升高的趋势一致，提示miR-19a可能在肝癌的发生发展中起到促癌作用。

miR-19a的促癌作用已经在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤细胞中被证实，miR-19a对癌细胞的增殖具有促进作用，对癌细胞的凋亡具有抑制作用[10-13]。本实验在肝癌细胞株HepG2中观察了miR-19a的促癌作用，在转染miR-19a mimic后检测到miR-19a的表达水平明显升高，过表达miR-19a后HepG2细胞的增殖活力增强，凋亡受抑制，与miR-19a在其他恶性肿瘤细胞中的促癌作用一致，表明miR-19a对肝癌细胞的增殖具有促进作用，对凋亡具有抑制作用。

miRNA发挥生物学作用的方式是与靶基因mRNA的3’UTR结合并抑制靶基因的表达。本实验通过Targetscan进行生物信息学分析发现，抑癌基因PTEN的3’UTR上含有miR-19a的结合位点，结合国内王红芳等[4]研究发现的肝癌中PTEN表达减少且与miR-19a呈负相关的结果推测，miR-19a可能在肝癌的发生发展中靶向PTEN基因。本实验在转染miR-19a mimic后，PTEN的表达水平降低，含有野生型PTEN基因mRNA 3’UTR的双荧光素酶报告基因的荧光活力下降，说明miR-19a能够在肝癌细胞中靶向抑制抑癌基因PTEN的表达。

PTEN基因的抑癌作用在多种恶性肿瘤中均被证实，该基因的编码产物具有双重特异性磷酸酶活性，能够抑制PI3K/AKT/mTOR通路中的信号分子发生去磷酸化并失活，进而抑制该信号通路激活所介导的促增殖、抗凋亡效应[14-16]。在明确miR-19a调节肝癌细胞增殖、凋亡并靶向抑制PTEN的表达后，本实验进一步验证了PTEN受抑制在miR-19a调节肝癌细胞增殖、凋亡中的作用。在设计过表达PTEN的质粒并与miR-19a mimic共同转染进入HepG2细胞后，miR-19a促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用发生了逆转，说明PTEN基因参与肝癌细胞增殖及凋亡的调控，过表达PTEN能够逆转miR-19a的调控作用，进而也提示miR-19a对肝癌细胞增殖、凋亡的调控与靶向抑制PTEN有关。

综上所述，miR-19a对肝癌细胞的增殖具有促进作用，对凋亡具有抑制作用，靶向PTEN是介导该作用的分子机制之一，未来可针对miR-19a设计抑制物并在细胞实验、动物实验中验证miR-19a抑制物治疗肝癌的价值。