microRNA在胃癌中的研究进展

张 雪， 李学良

南京医科大学第一附属医院消化内科，江苏 南京 210029

通讯作者：李学良，博士生导师，主任医师，教授，研究方向：消化道肿瘤的早期诊断和内镜下治疗、功能性胃肠病、中枢及外周摄食调节因子对胃肠动力的调整作用等

胃癌是一个全球性的健康问题，尽管其发病率和死亡率在过去几十年中有所下降，但它仍然是世界第五大最常见的癌症类型，也是第三大常见的癌症死亡原因[1]。据估计，2018年全球共有1 033 701例胃癌新病例(占所有确诊癌症病例的5.7%)和782 685例胃癌相关死亡病例(占所有癌症死亡人数的8.2%)[2]。胃癌患者的死亡率与其疾病分期密切相关，目前临床常用的胃癌肿瘤标志物如糖类抗原(CA724、CA125、CA199)，癌胚抗原(CEA)，胃蛋白酶原(PGⅠ、PGⅡ)对其早期诊断以及预后判断的价值较弱，许多患者在诊断时已处于晚期，手术及化疗的疗效有限，同时缺乏更多用于靶向治疗的分子标志物。因此，进一步探索胃癌的发生机制，寻找新的分子标志物，是降低胃癌死亡率的关键。

miRNA是一类在生物体内丰富存在的单链内源性RNA，通过降解靶信使RNA(mRNA)或抑制其翻译水平来控制基因表达。单个miRNA可以调控多达200个靶基因，这意味着人类超过1/3的蛋白质编码基因受到miRNA的调控[3]。许多研究表明，miRNA参与了细胞生长、增殖、分化、凋亡、血管生成、免疫应答等重要生物学过程，对肿瘤的发生、发展、治疗至关重要[4-5]。本文将着重介绍最新发现的几种与胃癌发病相关的miRNA，并讨论其作为生物标志物及特定治疗靶点的作用。

1 miRNA的生物特性与功能

成熟的功能性miRNA约有22个核苷酸，其生物发生涉及一系列复杂的步骤[3]。首先在细胞核中，RNA聚合酶Ⅱ从miRNA基因转录出一个具有几百到几千个碱基对的原代miRNA(pri-miRNA)，由Drosha酶及结合蛋白DGCR8，加工成约70个核苷酸的茎环前体(pre-miRNA)[6]，然后前miRNA被Ran-GTP依赖的核运输因子Exportin-5转运到细胞质中，Dicer-DRBP复合物将其进一步加工成包含成熟的miRNA链及互补链的RNA双链[7-8]。最后，成熟的单链miRNA被整合到RNA诱导沉默复合物(RISC)中，靶向mRNA的3’非翻译区(3’-UTRs)的互补序列，通过降解目标mRNA或阻断其翻译来发挥功能[9-10]。研究发现，许多miRNA在胃癌组织细胞中的表达有不同程度的上调或下调，miRNA可通过与癌基因、抑癌基因、其他癌症相关基因的相互作用，参与胃癌的发生发展过程[11-12]。近年最新研究的与胃癌发生发展相关的miRNA分子调控机制如表1所示。

表1 胃癌相关miRNA的功能特征Tab 1 Functional characterization of miRNA in gastric cancer

2 胃癌组织中表达上调的miRNA

2.1 miR-374Xu等[13]首次证实，与GES-1细胞系和正常胃组织相比，胃癌组织细胞中的miR-374a表达明显上调，抑制miR-374a的表达可抑制胃癌细胞的增殖。他们发现，SRCIN1是miR-374a在胃癌中的功能性调节因子，miR-374a可直接靶向SRCIN1 mRNA的3’-UTRs来促进胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭。Ji等[14]检测发现，胃癌患者血清中miR-374a-5p的表达水平明显高于胃炎患者和健康对照组者(P<0.001)，术后组患者miR-374a-5p的水平较术前显著降低(P<0.01)，这说明miR-374a-5p可能是一个良好的胃癌预后指标。另外奥沙利铂化疗后复发患者血清及耐药胃癌细胞中miR-374a-5p表达增加(P<0.05)，提示miR-374a-5p在胃癌化疗耐药中发挥了重要作用。经过进一步研究表明[14]，miR-374a-5p通过靶向Neurod1在体内外增强了胃癌细胞对奥沙利铂的耐药性，更重要的是外泌体介导的miR-374a-5p拮抗剂可以增加Neurod1的表达，促进细胞凋亡，抑制化疗耐药性。因此，miR-374a-5p的下调可能是提高胃癌细胞对化疗敏感性的新途径，有望为胃癌耐药性治疗提供新靶点。

2.2 miR-421miR-421是近年来新发现的与胃癌发生相关的一种miRNA，位于人类染色体1p34.23，是miR-200家族的重要成员之一[15]。Chen等[16]发现，在早期胃癌和胃癌前病变中miR-421的表达显著上调，ROC分析表明，miR-421诊断胃癌的灵敏性、准确性、特异性均优于传统肿瘤标志物(CEA、CA153、CA50)。Yang等[17]研究提示，Claudin11(CLDN11)可作为miR-421的靶标，miR-421直接与CLDN11 mRNA的3’-UTRs结合，下调其表达，从而作为癌基因促进胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭。Liu等[15]阐明了miR-421表达水平与胃癌进展及预后的关系，他们认为miR-421表达水平与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、部位、浸润深度、TNM分期、分化程度无相关性，而与淋巴结转移密切相关，生存分析表明miR-421高表达患者生存期明显短于miR-421正常患者(中位生存期分别为37.34个月和54.23个月，P<0.01)。Ge等[18]证实，miR-421在进展期胃癌中的表达明显高于局限性胃癌。通过靶向E-cadherin和caspase-3，miR-421的过表达可增强胃癌细胞的迁移、侵袭能力，抑制细胞凋亡，并且诱导胃癌细胞对顺铂的耐药性。综上，miR-421可作为胃癌重要的诊断、预后指标和潜在的治疗分子靶点。

2.3 miR-452miR-452由人类染色体Xq28区域编码，有研究表明，其在不同肿瘤中的表达水平和作用并不一致，在肺鳞癌[19]、乳腺癌[20]等中miR-452的表达显著降低，而在结直肠癌[21]中miR-452的表达明显升高。He等[22]研究首次发现，与正常胃黏膜上皮细胞系相比，胃癌细胞系(SGC7901、MKN28、BGC823、AGS)中miR-452的表达水平显著升高。并且通过双荧光素酶报告检测证实miR-452能与抑癌基因EPB41L3的3’-UTRs互补结合发挥靶向调控功能。他们建立了胃癌裸鼠移植瘤模型，检测发现高水平miR-452在模型中可下调EPB41L3的表达，使得胃癌移植瘤体积、重量明显增加。进一步阐明miR-452的异常高表达促进了胃癌细胞的恶性生物学行为，通过靶向性负调控EPB41L3的mRNA转录和蛋白表达水平影响胃癌细胞的增殖和迁移能力。

2.4 miR-675miR-675在人体内由lncRNA H19加工生成[23]。越来越多的证据表明，H19和miR-675在胃癌细胞和组织中的表达水平明显高于正常胃组织，在胃癌的发生发展中有着重要作用[23-27]。有研究发现，miR-675可通过靶向肿瘤抑制因子RUNX1来调控胃癌细胞的增殖，lncRNA H19/miR-675/RUNX1信号轴可作为潜在的预后标志物和治疗靶点[24]。Yan等[25]发现了miR-675的另一个新靶点FADD，miR-675的上调显著降低胃癌细胞中FADD mRNA和蛋白水平，lncRNA H19/miR-675通过直接靶向FADD抑制caspase-8和caspase-3的激活，从而参与调控胃癌细胞的增殖和凋亡。Liu等[26]评估了miR-675表达对胃癌患者总生存时间的影响，发现高水平的miR-675与较短的总生存期之间显著相关(P=0.00069)。同时发现，miR-675可直接与PITX1的3’-UTRs结合负调控其表达，miR-675/PITX1轴通过调节上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程和Wnt/β-catenin信号通路促进胃癌的增殖和侵袭。Ghaedi等[27]对胃癌患者血清中lncRNA-miRNA共表达谱进行研究，发现联合检测H19、MEG3、miR-675-5p的表达水平可区分正常对照者和胃癌患者，ROC分析显示，其灵敏性和特异性分别为88.87%和85%，有望成为胃癌的潜在诊断指标。

3 胃癌组织中表达下调的miRNA

3.1 miR-217Wang等[28]研究表明，miR-217在胃癌组织和细胞系中表达降低，而且较低的表达水平与较高的胃癌分级和TNM分期相关。同时他们采用荧光素酶报告检测和Western blotting证实glypican-5(GPC5)基因是miR-217的功能靶点。miR-217可能是胃癌中一种新的肿瘤抑制因子，通过下调GPC5的水平抑制细胞的生长和转移，降低胃癌细胞的增殖、侵袭能力。此后，Dong等[29]发现，miR-217类似物能有效地阻断lncRNA Hotair对胃癌细胞生长和转移的促进作用。Hotair是哺乳动物基因HOXC位点中的一种lncRNA[30]，在胃癌组织中的表达显著上调，lncRNA Hotair可作为分子海绵结合miR-217，负调控其在胃癌中的表达，上调GCP5的水平，从而促进胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭、免疫逃避。Dong等[29]认为，Hotair和miR-217水平可能是胃癌患者的预后指标，Hotair/miR-217/GCP5轴是胃癌患者潜在的治疗靶点。

3.2 miR-539Zhou等[31]发现，miR-539-3p在胃癌组织细胞中表达显著下调，miR-539-3p过表达抑制了胃癌细胞增殖和侵袭，这提示miR-539可能是胃癌中的一种肿瘤抑制因子。他们通过筛选确定CTBP1是miR-539-3p的一个靶基因，CTBP1的外源性表达可逆转miR-539-3p对胃癌细胞恶性增殖和侵袭的影响，而miR-539-3p过表达可通过抑制CTBP1调节胃癌的EMT过程。Ding等[32]也认为，miR-539可负向调控胃癌细胞的增殖和迁移，并通过实验证明SRY-box5(Sox5)是miR-539的靶基因，miR-539对胃癌的抑制作用可能是通过介导Sox5的表达间接调节EMT过程来实现的。Zhao等[33]提出SRY-box9(Sox9)基因是miR-539的另一直接靶点，miR-539通过降低Sox9的表达抑制胃癌细胞的恶性生物学特性。他们还发现lncRNA LINC00339可作为分子海绵结合miR-539调节Sox9基因的表达，LINC00339在胃癌组织和细胞系中表达异常升高，并且与胃癌患者的淋巴结转移、浸润深度、TNM分期、总生存期明显相关。LINC00339/miR-539/Sox9通路的研究将有助于理解胃癌发生的分子机制并为胃癌诊断、预后、治疗提供潜在靶点。

3.3 miR-567此前有研究报道，miR-567能够通过靶向FGF5抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭[34]，也可作为肿瘤抑制基因，抑制乳腺癌的发生发展[35]。Zhang等[36]研究发现，miR-567在胃癌组织和细胞中的表达较癌旁组织和胃上皮细胞明显下调，提示miR-567在胃癌进展中起抑制作用。体外实验表明，miR-567不仅削弱了胃癌细胞的增殖能力，还增加了胃癌细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)和奥沙利铂的化疗敏感性。首次证明miR-567是一个与胃癌发生发展以及化疗耐药相关的抑制基因。同时，他们发现PIK3AP1在miR-567介导的抑制胃癌细胞行为中起着至关重要的作用，miR-567作为上游调控因子，通过直接靶向PIK3AP1阻断了PI3K/AKT/c-Myc通路，c-Myc又可与miR-567基因的启动子区域结合，导致其转录受阻，反向调节miR-567的表达，从而形成miR-567-PIK3AP1-PI3K/AKT-c-Myc反馈环。反馈环的存在解释了miR-567作为抑癌基因的信号传导并调控胃癌细胞增殖、耐药的机制，有望为胃癌提供早期诊断及预后的生物标志物，并解决化疗耐药问题。

3.4 miR-618Shi等[37]检测了90对胃癌组织和癌旁组织中miR-618的表达水平，发现其在胃癌组织中的表达明显下调，ROC曲线图显示，miR-618在胃癌组织中的表达水平对胃癌的诊断具有较高的特异性(72.5%)和灵敏性(60.4%)，且miR-618的表达水平与胃癌淋巴结转移有关(P<0.05)，与肿瘤直径、分化程度、远处转移、TNM分期无关。进一步研究证实，miR-618对细胞周期或凋亡的影响不明显，但可通过负向调节靶基因TGF-β2的转录水平抑制胃癌细胞侵袭、迁移能力。Xun等[38]发现，miR-618在胃癌组织细胞中表达明显降低，与lncRNA Hotair和Krueppel-like factor12(KLF12)呈负相关，实验结果表明，KLF12可作为miR-618的直接靶点，miR-618通过靶向KLF12负调控胃癌细胞中的PI3K/ATK信号通路，发挥对胃癌细胞迁移、侵袭的抑制作用。而Hotair可通过海绵化miR-618促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡。Hotair/miR-618/KLF12/PI3K/ATK轴的发现有助于进一步揭示胃癌的发生机制。Zhang等[39]探究胃癌顺铂耐药的分子机制发现，miR-618可作为circRNA CCDC66的下游靶点，circCCDC66通过靶向miR-618显著抑制BCL2 mRNA和蛋白水平从而诱导胃癌的顺铂耐药性。

4 miRNA在胃癌中的作用

4.1 miRNA作为胃癌诊断和预后的生物标志物发掘高灵敏性和特异性的新型生物标志物，有助于改善对胃癌疾病的管理，包括胃癌的早期诊断、预后评估、复发监测、疗效评价。越来越多的研究探讨了miRNA作为胃癌生物标志物的价值，如Zhang等[39]研究证实，联合检测miR-221-3p和miR-122-5p的表达水平可用于诊断胃癌，其灵敏性为91.5%，特异性为82.7%。且这两种miRNA的表达与胃癌的分化程度、TNM分期、淋巴结转移、浸润深度显著相关，是胃癌术后独立的预后因素。Li等[41]发现，miR-625-3p在胃癌组织中表达下调，低表达患者的淋巴结和远处转移率明显增高，总生存率明显降低，可作为预测胃癌预后的指标。

循环miRNA是目前新兴研究领域，肿瘤源性miRNA可以稳定的形式存在于循环中，并且可以用较为便捷的方法检测和量化，增强了外周血中miRNA作为胃癌非侵入性诊断标志物的可行性。据报道[42]，胃癌患者血清游离miR-551b-5p水平明显下调，ROC分析显示，血清miR-551b-5p的表达可区分胃癌患者和健康对照组，其AUC值为0.84(灵敏性77.5%，特异性80.0%)，可作为胃癌早期诊断的血清学标志物。

4.2 miRNA对胃癌的治疗作用miRNA的失调与胃癌发生发展之间的关系说明了miRNA作为胃癌治疗靶点具有巨大的潜力。目前关于miRNA的治疗研究，集中在利用反义技术拮抗靶miRNA的表达，或是恢复或加强特定miRNA的功能抑制某些蛋白编码基因的表达。此外，化疗耐药是提高胃癌患者总体生存率及生活质量的难题，许多研究表明miRNA可以调控胃癌细胞的耐药性。如Bao等[43]发现，miR-101在耐药胃癌细胞株中表达显著降低，当上调miR-101的表达时，其可通过靶向Annexin A2(ANXA2)抑制细胞活性和促进细胞凋亡，逆转耐药胃癌细胞的耐药性。Gong等[44]研究确定了miR-625是胃癌细胞多药耐药性(multidrug resistance，MDR)的新型调节剂，miR-625直接靶向ALDH1A1促进细胞凋亡并逆转MDR。但由于miRNA具有多靶点特性，治疗有意外脱靶的风险，而靶基因的表达又受多个不同的miRNA调控，这对治疗效果也会有影响。因此，在基于miRNA治疗胃癌的应用中，还有很多问题亟待解决。

5 结论和展望

越来越多的研究证实miRNA在恶性肿瘤的发生发展中发挥了关键作用，为包括胃癌在内的许多癌症的诊断和治疗提供了新的思路。但我们仍然面临着许多挑战，miRNA具有组织、时间和空间特异性，并且受到体内外多种因素的影响，在复杂的基因调控网络当中，miRNA信号传递的准确识别十分困难。希望随着生物技术及转化医学的不断发展，我们能完整掌握miRNA的功能，开发出特异有效的miRNA递送系统，提高胃癌的诊断率，改善胃癌的治疗水平。此外，miRNA在癌细胞自噬、肿瘤血管生成及肿瘤转移、放疗耐药等中的作用还有待进一步研究。