微流控技术在结直肠癌诊疗中的应用研究

李 玮，田 山，廖 斐，董卫国

武汉大学人民医院 1.消化内科； 2.中心实验室，湖北 武汉 430060

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球最常见的癌症之一，其发病率和死亡率在恶性肿瘤中高居前五位[1]，全球每年诊断癌症和癌症相关死亡的人数中罹患CRC的人数占10%[2]。尽管CRC的治疗方案不断更新换代，但远期预后仍不尽人意。腹痛、大便习惯改变等临床表现，以及手术、放疗、化疗等治疗方式皆可影响患者生活质量。并且大多数CRC患者发展到晚期才出现症状，癌细胞转移是CRC患者最主要的致死原因，早期诊断及合理干预是防止癌细胞转移的关键，因此，提高早期发现率，降低CRC的死亡率十分必要。

微流控技术于20世纪90年代早期发展起来，该技术是以构建一个无支架或基于支架的非常小的载体，通常由微腔、微通道和功能化微结构构成，其尺寸从几十微米到几百微米不等，在体积10-18～10-9L液体环境中培养各种细胞，实现在液体流动条件下持续评估细胞、组织和器官的活性、特征等[3]。目前人们已经用多种材料和方法制备了各种各样的微流控装置，如聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)、硅、基质凝胶、琼脂糖等[4]。与细胞培养和动物模型等相比，微流控技术只需消耗很少的样本和材料，并且能用快速、灵敏和精确的分析方法分离并检测细胞、组织和器官的活性、特征等。鉴于以上优点，微流控技术在CRC中的相关应用研究成为近些年的研究热点。

1 微流控技术与CRC的发病机制

最近的肿瘤学研究显示，大多数CRC的起源细胞是癌干细胞(cancer stem cells，CSCs)，CSCs可形成与原发肿瘤相似的分化细胞群的继发肿瘤[2，5]。这一小部分细胞是肿瘤复发、转移和抗肿瘤治疗抵抗的主要原因。因此，研究CSCs生长的调节机制有望成为治疗和预防CRC的新方式。然而，CSCs细胞系缺乏可靠的鉴定方法。Hung等[6]设计并制造了一种新型的微流控系统，该系统利用微流控芯片成功地筛选出8种特异性适体，其中3种适体对各自的靶细胞，如结直肠癌干细胞(colorectal CSCs，CR-CSCs)表现出高度的亲和力，这些适体可以作为分离CSCs的配体。因此，微流控系统可以特定识别相关CSCs并进行有效分离，为进一步分析CSCs的特性等奠定基础。此外，越来越多的证据表明，miRNA表达失调在包括CRC在内的多种癌症的发病机制中起着关键作用[7-8]。miRNA的液体活检在疾病早期特别是在癌症早期有着良好的临床应用前景。Kara等[9]应用微流控芯片对54例CRC患者和42名健康对照者的结肠组织样本进行检测发现，与正常的组织相比，ADAMTS1、FHIT、RUNX1等基因在CRC组织中的表达明显改变，该研究提示癌症相关基因及其调控的miRNA参与了CRC的病理生理过程。传统获取细胞内miRNA最常用的分析方法是northern杂交、微阵列和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，但这些方法耗时、灵敏性低，而且成本高、过程复杂，并且需要熟练的操作技能。为了实现miRNA的快速提取并尽可能保存其完整性，Cai等[10]在微流控纸基分析装置(microfluidic paper-based analytical device，μPAD)基础上研制了一种激光诱导荧光传感器，该装置对miRNA-21和miRNA-31的检测具有超高的灵敏性，并在相应肿瘤细胞中成功地发现这两种miRNA。Behrmann等[11]设计的微流控芯片也可在短时间内从小体积样品中提取miRNA。以上均表明利用微流控技术进行CRC发病研究的价值，方法简便、灵敏、快速、经济，在CRC发病机制中具有广阔的应用前景。

2 微流控技术与CRC的早期诊断

传统CRC的诊断通常依靠有创性的方法，如直肠指诊、肠镜，与其他侵入性诊断方法一样，这些方法具有较高的风险，并可能导致患者的不适。其他诊断方法如粪便隐血试验价廉、简便，但假阳性率偏高。血清癌胚抗原(CEA)和碳水化合物抗原19-9(CA19-9)特异性有限。近年来循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)在肿瘤的早期诊断和治疗中受到广泛关注。CTCs是从肿瘤组织中逃逸出来并能进入血液循环中的肿瘤细胞，它通过血液循环携带到人体各处，并在继发部位定居，形成转移性肿瘤[12]。CTCs在癌症患者外周血中罕见，很难分离，1 ml全血所含的1×109血液学细胞中仅能检出1～100个CTCs[13]，这对CTCs的富集和分离提出了挑战。迄今为止，最完善的CTCs分离和计数系统即Cell Search系统，美国食品药品监督管理局(FDA)已批准用于转移性乳腺癌、CRC或前列腺癌，但该系统捕获的CTCs不适于生物标志物分析，因此只能用于确定CTCs的数量。到目前为止，已经研发出了多种分离CTCs的技术，如基于细胞大小的过滤装置，基于细胞密度的方法，基于蛋白质表达的特定分离方法等[12]。在此基础上，Cheng等[14]设计了一种三维PDMS支架为基础结构的微流控芯片，该装置从14例癌症患者的血液中检测出1～118个CTCs/ml，其中5例患者的血液样本中检测出1～14个CTC簇/ml，该芯片成功地结合了三维支架结构的特异识别和物理阻隔效应，显著提高了CTCs和CTC簇的捕获效率。此外，他们在芯片表面均匀配置热敏明胶水凝胶层，使得捕获的细胞从芯片中缓慢释放，并且具有较高的活性和完整性，这种热敏型的明胶微流控芯片对包括CRC在内的CTCs具有较高的捕获价值[15]。Baek等[16]利用微流控技术对88例CRC患者和31名正常志愿者血样进行检测并绘制ROC曲线发现，当临界CTCs值为5个/7.5 ml全血时，CRC患者与健康对照组的灵敏性和特异性分别为75%和100%，CTCs≥5个/7.5 ml的患者其总体生存期和无进展生存期呈下降趋势，这说明微流控技术检测CTCs对CRC的早期诊断和预后有很好的效果。

3 微流控技术与CRC的化疗

CRC是常见的消化道恶性肿瘤，其主要治疗手段是根治性手术、化疗、放疗、靶向治疗等多学科综合治疗。目前临床指南将奥沙利铂、伊立替康及氟尿嘧啶类药物列为CRC经典化疗方案[17]。然而许多化疗药物的高亲水性及低半衰期等特性常导致其在口服和静脉治疗CRC时疗效降低，如5-氟尿嘧啶(5-FU)。为解决这一难题，Toudeshkchouei等[18]利用微流控技术制备载有5-FU的聚乳酸-乙醇酸(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)共聚物纳米颗粒并对该纳米颗粒的药物释放、细胞毒性、细胞死亡等方面进行评估发现，载有5-FU的PLGA 纳米颗粒比单纯5-FU更易于控制释放，并且该纳米颗粒能够以渐进的速率和安全的药物剂量杀死CRC细胞。同样，为了增加唑来膦酸(zoledronic acid，ZA)的疗效，Di 等[19]将ZA包裹在半导体聚合物纳米颗粒(spherical polymeric nanoparticles,SPNs)的水核中，这些来源于外周血Vδ2t细胞的纳米颗粒能在微流控系统中向CRC细胞迁移，并且活化的Vδ2t细胞能够杀死CRC细胞，ZA-SPNs还可以刺激CRC患者肿瘤浸润淋巴细胞中的Vδ2t细胞增殖，增强其对自身肿瘤器官的细胞毒性。另外，肿瘤耐药是肿瘤治疗发展面临的普遍问题。实验室药物检测方法通常需要敏感和广泛的细胞培养等程序，而且传统的方法仅限于检测可触及的肿瘤。近年来，随着微流控技术针对化疗敏感性的检测方法提出，Velasco等[20]利用微流控技术进行个体化药物筛选，该设备依据细胞的电/电化学特性和形态特征精确分离和捕获人CRC细胞(HCT116)，并在治疗药物的影响下实时分析细胞并评估药物疗效，该微流控系统实现了从单细胞水平到细胞-药物相互作用的自动化和阵列分析，这有助于更好地了解肿瘤细胞的耐药性以及进一步优化患者的治疗方案。

4 微流控技术与CRC的转移判断

随着癌症治疗技术的进步，CRC患者的生存率明显提高，但肿瘤复发和转移仍很普遍。20%～45%的CRC患者在接受外科手术切除后，仍会以区域性淋巴结或远处转移的形式复发[1]。癌细胞的扩散会增加患者死亡风险。CTCs从实体肿瘤中脱落到血管系统，在肿瘤转移中起重要作用。目前微流控技术能分离和富集外周血CTCs且效率高、灵敏性高，但很少有方法能捕捉到体液中的转移性肿瘤细胞。为此，我们团队前期利用3D微流控芯片从包括CRC在内的恶性肿瘤转移至胸腹腔形成的胸腹水中有效分离出积液肿瘤细胞(effusion tumor cells，ETCs)和ETC簇(ETC/cluster)，并进一步利用ETC/cluster计数和积液CEA建立鉴别良恶性胸腹水的预测模型，预测模型的曲线下面积、灵敏性和特异性分别为0.939、90.4%和91.8%[21]，这证明了微流控技术对ETCs具有非常高的捕获效率及CRC腹腔转移的鉴别诊断价值。另外，血液中的游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)被证明也与CRC患者的预后相关。cfDNA通常来源于血液循环中凋亡或坏死的细胞，或淋巴细胞的释放，感染或炎症等也可导致其含量增加[12]。一项研究发现，复发性/转移性CRC患者组的血液中cfDNA含量明显高于原发性CRC患者组，原发性CRC患者组的cfDNA水平明显高于肠息肉患者组和健康对照组，说明cfDNA对CRC的早期辅助诊断、病情进展及预后监测具有重要价值[22]。传统重复离心提取DNA的方法会使cfDNA的纯度在回收过程中受到影响。Lee等[23]研究发明了一种无需离心就可以提取cfDNA的微流控芯片，使用该芯片可有效避免传统制作中的反复离心，大大缩短了样品制备时间，有助于cfDNA在癌症中的机制研究。此外，CRC细胞的外泌体与肿瘤发生、远处转移和化疗耐药性密切相关[24]。外泌体是一类直径为40～100 nm的胞外盘状囊泡，通过内分泌及旁分泌的方式释放到多种体液中，肿瘤来源的外泌体可以刺激新生血管形成、增强肿瘤侵袭能力，最终导致疾病进展及远处转移[25]。从复杂的体液样品中分离捕获外泌体仍具有很大挑战。相关研究证明，微流控技术主要通过类似基于外泌体的物理性质如密度、大小等的物理分离以及基于外泌体表面特异性标志物如CD63、CD9、CD81等的免疫亲和作用来分离，以此来实现外泌体的高效分离富集以及内含物解析的整合等[26]，这便于我们进一步获取肿瘤分子信息来实现癌症的早期诊断和疗效监测。

5 微流控技术与精准治疗

目前评估癌症治疗的方法准确率低、昂贵且复杂。使用活肿瘤细胞的功能测试平台对于药物开发和确定特定患者的最佳治疗，即精准肿瘤治疗，很有发展前景。器官芯片是由光学材料、玻璃或聚合物(如PDMS)组成的微流控细胞培养设备，通过在体外重建组织水平和器官水平的结构以研究体内器官的生理学和病理生理学[27]。Lee等[28]将多株胰腺癌细胞系和HT-29结肠癌细胞与其相应的癌特异性成纤维细胞、人胰腺星状细胞系、正常人结肠癌细胞CCD-18Co在器官芯片上共培养，发现这些基质细胞能够诱导癌细胞产生上皮间质转化(epithelial mesenchymal transtion,EMT)。Rodriguez等[29]开发了一种微流控平台，利用该装置的流体性能实现了对异种移植瘤和1例CRC患者的肿瘤切片的药物反应测试。另外，Velasco等[20]设计的微流控芯片能够精确捕获靶细胞，实时和连续地筛选药物对肿瘤细胞亚群的疗效，同时测量和表征候选治疗药物的有效性，实现了患者个体化疗效的筛选。

在精准治疗的背景下，更加精确地筛选有效人群实现个体化治疗、监测是今后的一个重要研究方向。微流控技术不仅具有微型化和自动化的特点，而且耗费耗材少、操作简便、特异性及灵敏性高，具有能够实现CRC相关生物标志物的高效分离富集以及下游的操作处理。因此，微流控技术用于药物开发和新的治疗发现具有很好的发展前景。