小干扰RNA沉默IKK/NF-κB信号通路对HSC-T6细胞凋亡的影响

张彦亮， 吴会玲， 岳巧艳， 宋 爽， 宋 希， 陶 臻

南京医科大学附属南京医院感染科(南京市第一医院)，江苏 南京 210006

论著·肝脏相关疾病

小干扰RNA沉默IKK/NF-κB信号通路对HSC-T6细胞凋亡的影响

张彦亮， 吴会玲， 岳巧艳， 宋 爽， 宋 希， 陶 臻

南京医科大学附属南京医院感染科(南京市第一医院)，江苏 南京 210006

目的 研究小干扰RNA(siRNA)沉默IKK/NF-κB信号通路对于肝星状细胞株HSC-T6凋亡的影响。方法 根据GenBank数据库IKKβ的cDNA序列,设计构建合成IKKβsiRNA，采用阳性脂质体转染，设立空白对照组、阴性对照组及siRNA实验组，采用TUNEL法和流式细胞仪Annexin-V/PI双染法测定IKKβsiRNA转染后24 h、48 h和72 h细胞凋亡率，同时采用Western blotting检测NF-κB P65、Bcl-2、Bax和Caspase3的蛋白表达情况。结果 与空白对照组和阴性对照组相比，实验组24 h、48 h和72 h HSC-T6细胞凋亡率均显著增加(P<0.05)，且具有时间依赖性；实验组的NF-κB P65及Bcl-2蛋白的表达均明显升高，而Caspase3和Bax则显著增加，与空白对照和阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 SiRNA沉默IKK/NF-κB信号通路能够下调NF-κB P65的表达，同时提高Bax和Caspase3的表达，促进HSC-T6凋亡，这种肝星状细胞凋亡诱导效应具有潜在的逆转肝纤维化的治疗作用。

小干扰RNA；肝纤维化；肝星状细胞；IKK/NF-κB信号通路；凋亡

肝纤维化是各种病因引起的肝脏慢性进行性的病理过程，肝纤维化的效应细胞肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)的激活、增殖并产生分泌大量ECM是肝纤维化形成的关键环节，已有多个研究显示通过诱导活化的HSC发生凋亡能够逆转肝纤维化过程。因此笔者利用体外细胞培养技术，采用小干扰RNA(siRNA)抑制肝星状细胞株HSC-T6中IKKβ基因的表达，沉默IKK/NF-κB(nucler factor-kappaB, 核因子κB)信号通路，研究其对HSC-T6细胞凋亡的影响，为临床肝纤维化逆转治疗探索新的靶点和方法。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠肝星状细胞株HSC-T6购自南京凯基生物科技发展有限公司；脂质体Lipofectamine 2000、TRIzol购自美国 Invitrogen公司；RPMI-164购自美国 GIBCO公司；DMSO(溶解Formazan结晶)购自中国上海久亿化学试剂有限公司，cDNA第一链合成试剂盒及Taq DNA Polymerase均购自美国 Thermo Fisher公司；Agarose购自西班牙Biowest 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组：HSC-T6细胞含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素的DMEM培养液进行传代培养。实验时分为空白对照组、阴性对照组、IKKβsiRNA转染实验组。

1.2.2 设计构建合成IKKβsiRNA：通过NCBI的GenBank数据库搜索IKKβ的cDNA序列, 按照siRNA设计原则设计合成IKKβsiRNA，采用RT-PCR检测siRNA表达对IKKβ基因表达的影响，选取抑制效率最佳的IKKβsiRNA用于实验(RNA合成由上海吉玛制药技术有限公司，引物合成由南京金斯瑞科技有限公司)。SiRNA-1014：S：5′-CCCUCGAUGACAUCUUGAAUU-3′；AS：3′-UUGGGAGCUACUGUAGAACUU-5′。

1.2.3 转染IKKβsiRNA：转染接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到50%～60%；用250 μl不含血清培养基Opti-MEM稀释20 μmol/L的贮存液轻轻混匀，室温孵育5 min；用250 μl不含血清培养基Opti-MEM稀释5 μl lipo2000，轻轻混匀并室温孵育5 min；将两者轻轻混匀，室温孵育20 min；将siRNA-lipo2000混合液加入含有细胞的500 μl培养基的培养孔中，轻轻混匀培养4～6 h 后，将孔中含siRNA-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜培养基置于37 ℃的CO2培养箱中培养。

1.2.4 Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡：将对数生长期的细胞消化接种到60 mm培养板中，培养24 h，待细胞贴壁后，根据组别设置加入相应的含药培养基，同时设立阴性对照组。作用24 h、48 h、72 h后，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集细胞洗涤离心收集5×105个细胞； 加入500 μl的Binding Buffer悬浮细胞；加入5 μl Annexin V-FITC混匀后，再加入5 μl Propidium Iodide，混匀反应5～15 min后用流式细胞仪检测(Ex=488 nm; Em=530 nm)细胞凋亡的情况。再次收集5×105个细胞的单细胞悬液用体积分数为70%乙醇固定2 h(或过夜)，4 ℃保存后洗涤；加100 μl RNase A 37 ℃水浴30 min，再加入400 μl PI染色混匀，4 ℃避光30 min后上机检测，记录激发波长488 nm处红色荧光。

1.2.5 TUNEL法检测细胞凋亡：预处理细胞后加1%的Triton-100使之通透，经过PBS浸泡洗涤3次后加3% H2O2甲醇溶液对酶进行灭活，重复洗涤。在每个样本中滴加100 μl TdT酶反应液，避光湿润37 ℃反应1 h后洗涤。滴加100 μl Streptavadin-HRP，避光湿润37 ℃反应30 min。DAB法显色，终止显色后复染并封片，使用光学显微镜进行观察，选取10个高倍视野，每个视野计数300个细胞，计算3 000个细胞中阳性细胞所占的比例，即凋亡率。

1.2.6 Western blotting检测凋亡相关蛋白表达：提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转移至NC膜上，5%脱脂奶粉封闭1.5～2 h 后，分别用一抗和二抗进行反应后与免疫印迹化学发光试剂(ECL)反应。X线片曝光、显影、定影后分析表达情况，计算凋亡指数(AI)：细胞凋亡指数(AI)=凋亡细胞数÷细胞总数×100%。

2 结果

2.1 Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡 空白对照组24 h、48 h、72 h的凋亡率分别为(2.38±0.25)%、(3.86±0.37)%、(4.62±0.35)%；阴性对照组分别为(3.65±0.41)%、(3.95±0.81)%、(5.53±0.85)%；实验组分别为(9.24±2.32)%、(19.35±4.15)%、(27.33±7.37)%，实验组与其他两组3个时间点比较差异均有统计学意义(F=14.21,P<0.05;F=25.32,P<0.05，见图1)。

2.2 TUNEL法检测细胞凋亡 空白对照组24 h、48 h、72 h的凋亡率分别为(5.29±0.72)%、(7.29±0.98)%、(10.76±1.53)%；阴性对照组分别为(6.25±1.38)%、(7.96±1.56)%、(9.6±2.15)%；实验组分别为(15.18±3.96)%、(24.48±5.12)%、(31.44±5.25)%，实验组与其他两组3个时间点比较差异均有统计学意义(F=21.79,P<0.05;F=41.21,P<0.01，见图2)。

2.3 Western blotting检测凋亡相关蛋白表达 IKKβsiRNA干预后实验组的NF-κB P65及Bcl-2蛋白表达明显减少， 而Caspase3和Bax蛋白表达则有显著增加，且这种效应具有时间相关性，与空白对照组和阴性对照组比较4种凋亡相关蛋白差异均有统计学意义(F=31.7,P<0.05)，两对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),而实验组在3个时间点与两对照组比较4种凋亡蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.05，见图3、4)。

图1 Annexin V/PI检测HSC-T6细胞凋亡 A:空白对照组；B:阴性对照组；C:SiRNA实验组

Fig 1 Apoptosis rate of HSC-T6 cells detected by AnnexinV/PI double staining A: blank control group; B: negative control group; C: experimental group

图2 TUNEL法检测细胞凋亡 A:空白对照组; B:阴性对照组; C:siRNA实验组

Fig 2 Apoptosis rate detected by TUNEL staining A: blank control group; B: negative control group; C: experimental group

注：与空白对照组比较, *P<0.05；与阴性对照组比较, △P<0.05。

图3 IKKβsiRNA对HSC-T6相关凋亡蛋白表达的影响

Fig 3 Effect of IKKβsiRNA on the expression of HSC-T6 related apoptosis protein

注：A:空白对照组；B:阴性对照组；C:SiRNA实验组；1：24 h; 2:48 h; 3:72 h。

图4 IKKβsiRNA对HSC-T6相关凋亡蛋白表达的影响

Fig 4 Effect of IKKβ siRNA on the expression of HSC-T6 related apoptosis protein

3 讨论

在肝纤维化的病理机制中,大量激活的HSC起主导作用,目前认为激活的HSC有4种去向：(1)由激活型转变回静止型；(2)发生细胞凋亡；(3)免疫清除；(4)衰老[1]。其中凋亡途径不但可以减少激活增殖HSC 数量,也不引起溶酶体等细胞器的破坏,且凋亡的细胞可在数小时内被周围的内皮细胞或枯否细胞吞噬, 因而很少引起微环境的炎症损伤,是一种理想的清除HSC 的方式，多个研究显示如能诱导HSC凋亡则能够逆转肝纤维化的病理过程[2-3]。

多个研究表明NF-κB具有抗凋亡作用，在静息状态下其与抑制蛋白IκB结合呈无活性状态，当受内毒素、TNF等外界信号刺激后, IκB在蛋白激酶IKK的作用下发生磷酸化降解, NF-κB由胞质迅速移位至胞核, 与特异性κB序列结合, 诱导抗凋亡相关基因转录，发挥抗凋亡效应[4-5]。而IKK复合体(IκB 激酶)是NF-κB 信号通路的主要调节物，它由3个亚基组成，其中IKKβ尤为重要，将鼠的IKKβ基因敲除后, NF-κB活化受到严重抑制，鼠胚胎时期即会死亡, 并会由于肝脏细胞发生凋亡而表现出肝脏退化病变。已有实验研究证明，将NF-κB基因敲除能显著促进HSC的凋亡并减少细胞外基质的产生[6-7]。研究发现，姜黄素和丹皮酚等中药单体均能够显著抑制肝星状细胞的NF-κB的活化，从而使活化的肝星状细胞凋亡增加，发挥其抗纤维化效应[6-7]。学者Oakley等[8]采用选择性的NF-κB抑制剂柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine，SASP)进行干预，结果发现SASP在体内和体外实验均能诱导HSC凋亡，减少细胞基质的合成。

本研究通过构建siRNAIKKβ沉默HSC-T6 IKK/NF-κB信号通路，结果发现NF-κB P65蛋白表达水平明显降低，同时流式细胞仪Annexin V/PI双染法和Tunel法检测均显示实验组HSC-T6细胞凋亡率显著增加，与空白对照组及阴性对照组比较有显著性差异，由此可见抑制NF-κB的活化能显著增加肝星状细胞的凋亡，这与在肿瘤、肾脏病领域的研究相类似[7-8]。同时Western blotting结果显示实验组凋亡相关蛋白Bcl-2的表达明显下降，而Caspase3和Bax蛋白表达则显著增加，与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)，且这种效应具有时间相关性，由此可见IKK/NF-κB信号通路对细胞凋亡的调控作用系通过调节相关凋亡、抗凋亡蛋白的表达来实现，阻断其通路能诱导促凋亡蛋白Bax和Caspase3表达的增加，促进细胞凋亡的发生。

由此可见肝纤维化过程中，IKK/NF-κB信号通路扮演着重要的角色，其能抑制HSC的凋亡，使得活化的HSC数量维持在高水平状态，最终导致肝脏内细胞外基质的异常沉积发展成为肝纤维化甚至肝硬化，沉默其信号通路则能够显著抑制NF-κB活性，从而促进HSC的凋亡，将有可能成为逆转肝纤维化，以IKK/NF-κB信号通路为靶点的治疗策略具有非常好的临床应用前景。

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(责任编辑：王全楚)

Effects of small interfering RNA silencing IKK/NF-κB on the apoptosis of HSC-T6

ZHANG Yanliang, WU Huiling, YUE Qiaoyan, SONG Shuang, SONG Xi, TAO Zhen

Department of Infectious Disease, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210006, China

Objective To investigate the effects of small interfering RNA (siRNA) silencing IKK/NF-κB on the apoptosis of hepate stellate cell line T6 (HSC-T6). Methods Chemically synthesized siRNA directed against IKKβ was transfected into HSC-T6 by cationic liposome Lipofectamine. The cells were divided into blank control group, negative control group and experimental group. TUNEL staining and AnnexinV/PI double staining with Flow cytometry (FCM) were used to detect the apoptosis rate of the cells at 24 hours,48 hours, 72 hours. The protein levels of NF-κB P65, Bcl-2, Bax and Caspase3 were analyzed by Western blotting. Results Compared with the negative control group and blank control group, the apoptosis rate in experimental group was increased significantly with time (P<0.05). In the experimental group, the expressions of NF-κB P65 and Bcl-2 were decreased significantly, while the expressions of Caspase and Bax were increased compared with the negative control group and blank control group (P<0.05). Conclusion SiRNA silencing IKK/NF-κB can down-regulate the expression of NF-κB P65, while can increase the expressions of Bax and Caspase3, by which can promote apoptosis of HSC-T6. This may be a potential strategy for the reverse effect of hepatic fibrosis.

SiRNA; Liver fibrosis; Hepatic stellate cell; IKK/NF-κB signal pathway; Aptoptosis

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.013

南京市卫生科技发展项目 (QYK11173)

张彦亮，副主任医师，硕士生导师，研究方向：复杂疑难重症感染性疾病。E-mail: swinburn@163.com

陶臻，主任医师，硕士生导师，研究方向：呼吸系统感染性疾病。E-mail: tz1010@126.com

R575

A

1006-5709(2016)11-1258-04

2016-02-15