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Wdr5通过Wnt通路促进肝癌细胞增殖

时间:2024-09-03

王晓锋,王玉平,魏文珍,胡晓丹,李瑞英,周永宁

兰州大学第一医院 1.消化科;2.甘肃省胃肠病重点实验室;3.感染科,甘肃 兰州 730000

Wdr5通过Wnt通路促进肝癌细胞增殖

王晓锋1,2,3,王玉平1,2,魏文珍1,2,胡晓丹1,2,李瑞英1,2,周永宁1,2

兰州大学第一医院 1.消化科;2.甘肃省胃肠病重点实验室;3.感染科,甘肃 兰州 730000

目的 研究Wdr5对肝癌细胞增殖的影响及其可能的机制。方法 构建Wdr5的shRNA病毒感染肝癌细胞系Huh7和HepG2下调Wdr5的表达,进而通过克隆形成实验和MTT等方法检测下调Wdr5表达后对细胞增殖的影响。结果 下调Wdr5后,肝癌细胞系Huh7和HepG2的克隆形成、细胞增殖能力显著降低,Wnt通路关键基因APC和β-catenin显著降低。结论 下调Wdr5能抑制肝癌细胞增殖,这一过程可能是通过Wnt通路进行的。

Wdr5;肝癌;增殖;Wnt通路;APC;β-catenin

原发性肝细胞癌(hepatocelluar carcinoma, HCC)是最常见的致死性恶性肿瘤之一[1-2]。我国肝癌的发病率和死亡率都显著高于世界平均水平[3-4]。由于绝大多数的肝癌确诊时已处于晚期,常规的手术以及介入、放化疗等手段已经难以奏效[5-6]。深入研究肝癌发生的分子和细胞学机制,将为肝癌的早期诊断、预防和治疗提供新的理论基础[7-8]。Wdr5(WD repeat-containing protein 5) 是WD-40蛋白家族的成员之一,同时也是染色体H3修饰蛋白复合体Trithorax group(TrxG)的重要组分之一[9-10]。研究发现Wdr5在胚胎干细胞的全能性维持、分化及肿瘤形成等过程中发挥着重要的作用[11-16]。其异常激活并持续性活动与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关[17-19]。然而关于Wdr5在肝癌细胞中的功能和具体机制的相关研究并未见报道。本研究通过慢病毒系统干扰Wdr5在肝癌细胞系Huh7和HepG2中的表达,进而研究Wdr5对肝癌细胞的影响并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞来源与试剂 人肝癌细胞293T细胞、Huh7和HepG2(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库),MTT(美国Sigma公司),细胞基础培养基(MEM,美国Hyclone公司),磷酸盐缓冲液(PBS,美国Hyclone公司),特级胎牛血清(FBS,美国Hyclone公司),PLVX-shRNA2(美国clontech公司),胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%,美国Gibco公司),Polybrene(美国Sigma公司),100×双抗(青霉素+链霉素,美国Gibco公司),DNA转染试剂FuGene HD(瑞士罗氏公司),反转录试剂盒以及定量PCR试剂盒(日本Takara公司),Wdr5、Gapdh、APC、β-catenin抗体(英国abcam公司),shRNA引物以及定量PCR引物合成(上海生工)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: Huh7细胞和HepG2细胞培养于含10%特级胎牛血清、青霉素和链霉素各100 U/ml的DMEM培养液中,于37 ℃培养箱中培养。

1.2.2 Wdr5 shRNA质粒的构建、病毒包装及感染: shRNA序列从Sigma-Aldrich公司的网站上获得,具体序列见表1。在病毒包装时,将上述质粒和包装质粒通过FuGene HD转染进293T细胞中,8 h之后换液,48 h之后收集第1批病毒样本,72 h之后再收集第2批病毒样本,用0.22 μm的滤器过滤除菌。感染肝癌细胞系采用悬浮感染的方式。肝癌细胞消化计数之后,将2×105个细胞铺于6孔板中,每个孔中加入1 ml普通培养基和0.5 ml病毒液,每个孔再加入1.5 μl的polybrene(8 μg/ml polybrene),12 h之后,将病毒液换成新鲜的培养基,并进行传代。每个感染的细胞都带有绿色荧光标记,通过流式细胞仪筛选出感染了病毒的细胞。

1.2.3 定量PCR: Trizol一步法提取总RNA。每个样本加0.5 μg的总RNA,通过反转录试剂盒反转录成cDNA。定量PCR的扩增条件为:预变性:94 ℃ 4 min;循环:94 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s。定量PCR检测采用automated Stratagene Mx3000 QPCR system,以Gapdh为内参。采用2-△△CT方法进行分析。

1.2.4 Western blotting蛋白检测: 需要收集的细胞样本用PBS洗1次,消化后计数,将相同数目的细胞收集到1.5 ml EP管中,采用1×SDS上样缓冲液对细胞进行裂解,在95 ℃的金属浴中热变性5 min后进行下一步实验。

表1 shRNA和定量PCR引物序列

Tab 1 Primer sequences of shRNA and quantitative RCR

名称序列(5′→3′)shWdr5APFgatccCCAACCTTATTGTCTCAGGATCTCGAGATCCTGAGACAATAAGGTTGGTTTTTgshWdr5APRaattcAAAAACCAACCTTATTGTCTCAGGATCTCGAGATCCTGAGACAATAAGGTTGGgshWdr5BPFgatccCCAACCTTATTGTCTCAGGATCTCGAGATCCTGAGACAATAAGGTTGGTTTTTgshWdr5BPRaattcAAAAACCAACCTTATTGTCTCAGGATCTCGAGATCCTGAGACAATAAGGTTGGgWdr5PFAATTCAGCCCGAATGGAGAGTWdr5PRAGGCTACATCGGATATTCCCAGAPCPFAAAATGTCCCTCCGTTCTTATGGAPCPRCTGAAGTTGAGCGTAATACCAGTβ⁃cateninPFCATCTACACAGTTTGATGCTGCTβ⁃cateninPRCATCTACACAGTTTGATGCTGCTGapdhPFGGAGCGAGATCCCTCCAAAATGapdhPRGGCTGTTGTCATACTTCTCATGG

1.2.5 克隆形成实验: 将细胞样本用PBS洗1遍,消化之后进行计数。克隆形成实验用6孔板进行,每个样本在每个孔中加500个细胞,3 d后换液,之后每隔2 d换液,10 d后进行检测。细胞吸去培养基,用PBS洗1次,加入甲醇进行固定20 min,之后去除固定液在室温晾置10~15 min,待固定液干了之后,加入1%(w/v)结晶紫染液进行染色,染色30 min,弃去染液,用5 ml/孔超纯水洗涤3次,弃去洗涤液,室温静置5~10 min,待洗涤液风干后,在光学显微镜下观察克隆形态,然后用数码相机拍照,记录每孔形成克隆数目的情况。

1.3 统计学处理 实验数据采用GraphPad Prism 4.0软件处理,应用Student’s t-test进行检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Wdr5-shRNA慢病毒感染肝癌细胞系鉴定 为了研究Wdr5在肝癌细胞系中的作用,我们构建了两个Wdr5的shRNA:shWdr5 A和shWdr5 B。在测序检测结果显示正确之后,将这两个shRNA质粒和对照质粒共同包装病毒,收集病毒后进行肝癌细胞的感染。为了排除细胞系的影响,我们采用了两个肝癌细胞系:Huh7和HepG2。感染2 d后发现许多细胞携带绿色荧光,提示感染成功,进行2次传代后进行流式细胞仪筛选,重新铺板之后进行检测,两个细胞系的样本中细胞携带有绿色荧光,表明感染病毒成功(见图1)。

2.2 Wdr5-shRNA慢病毒干扰效果检测 对Huh7中Wdr5的干扰效果进行检测,定量PCR结果显示,Wdr5的表达水平降低,shWdr5 A和shWdr5 B都具有非常显著的干扰效果(见图2A)。又在蛋白水平检测shWdr5 A和shWdr5 B的干扰效果,结果显示,在蛋白水平,Wdr5的表达也被显著抑制,这与mRNA表达的结果一致(见图2C)。在HepG2细胞中也通过定量PCR和Western blotting检测了Wdr5的表达效果,结果与Huh7的结果一致(见图2B、2D)。

2.3 干扰Wdr5能抑制肝癌细胞系增殖 在成功构建Wdr5干扰细胞系后,进一步检测Wdr5被干扰之后对肝癌细胞增殖的影响。MTT实验显示,在Huh7细胞中,干扰Wdr5后,与对照组比较,干扰组细胞增殖能力明显降低(见图3A)。为了进一步验证这一结果,又在HepG2细胞中进行检测,结果显示干扰组的细胞增殖能力与对照组比较明显降低,与Huh7的结果非常一致(见图3B)。同时,也通过克隆形成实验结果对肝癌细胞系的增殖能力进行研究,与之前MTT实验结果也一致(见图3C、3D)。

图1 Wdr5-shRNA慢病毒能够高效感染Huh7细胞系和HepG2细胞系(100×) A : Huh7细胞系;B: HepG2细胞系

Fig 1 Huh7 and HepG2 cells were infected by Wdr5-shRNA through lentiviral transfection(100×) A: Huh7 cells B: HepG2 cells

图2Wdr5-shRNA慢病毒能够在Huh7细胞系和HepG2细胞系中有效沉默Wdr5的表达A:qRT-PCR检测Huh7细胞系中Wdr5的表达;B:qRT-PCR检测HepG2细胞系中Wdr5的表达;C:Westernblotting检测Huh7细胞系中Wdr5的表达;D:Westernblotting检测HepG2细胞系中Wdr5的表达

Fig2TheexpressionofWdr5inHuh7andHepG2cellsweresignificantlydownregulatedaftertansfectionA:theexpressionofWdr5wasdetectedbyqRT-PCRinHuh7;B:theexpressionofWdr5wasdetectedbyqRT-PCRinHepG2;C:theexpressionofWdr5wasdetectedbyWesternblottinginHuh7;D:theexpressionofWdr5wasdetectedbyWesternblottinginHepG2

图3 沉默Wdr5能够抑制肝癌细胞增殖A:MTT法检测Huh7细胞增殖;B:MTT法检测HepG2细胞增殖;C:Huh7细胞系的细胞克隆形成;D:HepG2细胞系的细胞克隆形成

Fig3ThecolonyformationandcellproliferationwereallinhibitedafterWdr5knockdownA:theHuh7proliferationwasobservedbyMTT;B:theHepG2proliferationwasobservedbyMTT;C:theHuh7proliferationwasobservedbycolonyformationassays;D:theHepG2proliferationwasobservedbycolonyformationassays

2.4 干扰Wdr5能抑制Wnt通路 定量PCR结果显示:在Huh7细胞中,Wdr5被干扰后,Wnt通路关键基因APC和β-catenin的表达被显著下调(见图4A、4B)。进一步的Westernblotting结果显示,在蛋白水平,这两个关键基因的表达也被抑制(见图4C)。

注:与对照组比较,*P<0.05。

图4 沉默Wdr5基因能够抑制Wnt通路的表达 A:qRT-PCR检测APC基因的表达;B:qRT-PCR检测β-catenin基因的表达;C:Western blotting检测APC基因和β-catenin基因的表达

Fig 4 The expression levels of APC and β-catenin were all down-regulated after Wdr5 knockdown A: the expression of APC was detected by qRT-PCR; B: the expression of β-catenin was detected by qRT-PCR; C: the expression of APC and β-catenin were detected by Western blotting

3 讨论

目前,肝癌是国内发病率和死亡率第2高的恶性肿瘤。深入研究肝癌发生和发展的分子机制,找出肝癌中的关键基因或者表面标记基因,将为肝癌的临床诊断、临床治疗和药物开发提供重要意义。在这一研究中,我们发现了一个影响肝癌细胞的重要基因:WD-40蛋白Wdr5。它对肝癌细胞的增殖具有重要的作用,当它被干扰时,肝癌细胞系Huh7和HepG2的表达都被显著抑制,这一影响并没有细胞系特异性,因此它可能对肝癌细胞具有较为普遍的作用。这一结果显示,Wdr5表达量的高低可以反映肝癌细胞的增殖能力,当肝癌细胞高表达Wdr5时,细胞增殖能力强。在临床上,Wdr5可以作为反映肝癌增殖能力及恶性程度的一个潜在指标。

Wdr5是染色体H3修饰蛋白复合体TrxG的重要组分之一,当H3的第4位赖氨酸被TrxG催化三甲基化时,则能降低染色体的折叠,促进染色体的开放,进而促进所在基因的表达。因此高表达Wdr5能促进基因的表达,而干扰Wdr5则能抑制基因的表达。在本研究中,我们也发现Wdr5被干扰后能够抑制Wnt通路重要蛋白APC和β-catenin的表达。Wdr5可能通过影响APC和β-catenin等基因的启动子区的组蛋白H3K4的甲基化修饰来调节这两个基因的表达,当然这还需要进一步的研究。

总之,我们的研究发现Wdr5对肝癌细胞系的增殖具有重要调节作用,且这一作用的重要机制之一是它能够影响Wnt通路中的关键基因APC和β-catenin的表达,这对肝癌增殖调节的研究和肝癌的诊断治疗应用具有重要的价值。

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(责任编辑:王全楚)

Wdr5 promoting cells proliferation in hepatocelluar carcinoma through Wnt signaling pathway

WANG Xiaofeng1,2,3, WANG Yuping1,2, WEI Wenzhen1,2, HU Xiaodan1,2, LI Ruiying1,2, ZHOU Yongning1,2

1.Department of Gastroenterology; 2.The Key Laboratory for Gastrointestinal Diseases of Gansu Province; 3.Department of Infectioous Diseases, the First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China

Objective To study the effect of Wdr5 on cells proliferation in hepatocellular carcinoma by constructing the Wdr5 knock-out cell models.Methods Two shRNAs targeting Wdr5 were generated: shWdr5 A and shWdr5 B, and then infected Huh7 and HepG2 cells by lentiviral transfection. The expression of Wdr5 was detected by qPCR and Western blotting. MTT and colony formation assays were used to observe the effect of Wdr5 on cell proliferation. The expressions of APC and β-catenin were also tested at mRNA and protein level after Wdr5 silencing. Results The expression of Wdr5 in Huh7 and HepG2 cells was significantly down regulated after tansfection. The colony formation and cell proliferation were all inhibited after Wdr5 knockdown. And the expressions of APC and β-catenin were all down-regulated after Wdr5 knockdown.Conclusion Down regulating the expression of Wdr5 could inhibit the cells proliferation of hepatocellular carcinoma, and this could be involved in the regulation of APC and β-catenin in Wnt pathway.

Wdr5; Hepatocelluar carcinoma; Proliferation; Wnt; APC; β-catenin

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.014

R735.7

A

1006-5709(2016)11-1262-05

2016-03-09

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