肝素结合表皮生长因子对部分肝移植大鼠肝细胞CyclinD1表达的影响

周立新，苏继钦，王茂林，严辉弟，林培艺

厦门市第二医院肝胆外科，福建 厦门 361021

肝素结合表皮生长因子对部分肝移植大鼠肝细胞CyclinD1表达的影响

周立新，苏继钦，王茂林，严辉弟，林培艺

厦门市第二医院肝胆外科，福建 厦门 361021

目的 观察肝素结合表皮生长因子(heparin-binding epidermal growth falrtor like growth factor, HB-EGF)对部分肝移植大鼠肝细胞CyclinD1表达的影响，并探讨其促进肝再生的机制。方法 首先采用改良的“两袖套”法构建大鼠部分(60%)肝移植模型，共75只，受体随机平均分为A、B、C三组。其中，A组经皮下注射生理盐水(100 mg/kg)，B组皮下注射HGF(100 mg/kg)，C组为皮下注射HB-EGF(100 mg/kg)，1次/d。手术后第1天 、第2天 、第3天 、第5天和第7天各处死5只受体大鼠，采用实时荧光定量PCR、Western blotting 检测肝组织中CyclinD1 mRNA及蛋白的表达。结果 RT-PCR 检测结果表明，C组术后第1天CyclinD1 mRNA表达就达到高峰，且显著高于A、B组(P<0.05)，之后1周逐渐降低；Western blotting 检测结果表明，三组CyclinD1 蛋白表达水平均有上升，但C组术后第1天即达到高峰，且显著高于A、B组(P<0.05)。结论 HE-EGF可能通过上调肝移植后肝细胞 CyclinD1 的表达来促进肝再生。

肝素结合表皮生长因子；部分肝移植；肝再生；CyclinD1

肝素结合表皮生长因子(heparin-binding epidermal growth factor like growth factor, HB-EGF)是一种新的生长因子，属于完全促有丝分裂原，由Besner等[1-2]在1990年首次在人巨噬细胞培养物中分离得到。研究表明，HB-EGF对大鼠部分肝移植后的肝再生有明显的促进作用，且其促进作用优先于肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)。但其具体机制尚不明确。本实验外源性HB-EGF和HGF注入部分肝移植大鼠模型，应用RT-PCR及Western blotting方法检测实验后细胞周期因子CyclinD1 mRNA和蛋白表达的变化，进一步认识HB-EGF对肝移植后肝细胞再生影响的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 肝素结合表皮生长因子(ProSpec，艾美捷科技有限公司)，肝细胞生长因子(sciencecell，美国)，总RNA提取试剂(Sigma-Aldrich， 德国)，低溶点琼脂糖 (Amresco，美国)，DNA分子量标准(50 bp Ladder)(Amresco，美国)，引物合成与探针修饰(金斯瑞生物科技有限公司)，兔抗人CyclinD1多克隆抗体(上海笃玛生物科技有限公司)，PCR 扩增仪(德国Bio-Bid公司) ，自动酶标检测仪(美国Molecular Devices公司) 。

1.2 实验动物及分组 健康、雄性Wistar大鼠，鼠龄体质量200～220 g，购自厦门大学医学院实验动物中心。且供、受体体质量差距控制在10 g以内。以改良的“两袖套”法建立大鼠部分(60%)肝移植模型，受体随机分为三组：A组：术后皮下注射生理盐水(100 mg/kg，1次/d)；B组：术后皮下注射HGF(100 mg/kg，1次/d)；C组：术后皮下注射HB-EGF(100 mg/kg，1次/d)。分别于术后第1、2、3、5、7天各组处死5只受体大鼠。

1.3 半定量RT-PCR检测CyclinD1 mRNA的表达 提取细胞总RNA，具体方法采用TRIzol一步提取, 保存于-70 ℃超低温冰箱中。然后由AMV逆转录酶合成cDNA第1链，随后进行PCR扩增。最后，取10 μl的产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，并使用凝胶成像系统观察结果，与内参GAPDH灰度比值表示。

根据NCBI Genebank中大鼠HO-1基因序列，引物及探针的设计如下：RCYCLIND1F-2 5′-ACAACTCTATCCGCCCCGA-3′，RCYCLIND1R：5′-GAGGGTGGGTTGGAAATGA-3′ 217 bp; R-GAPDHF:5′-CCTCAAGATTGTCAGCAAT-3′，R-GAPDHR:5′-CCATCCACAGTCTTCTGAGT-3′, 141 bp。

1.4 Western blotting检测CyclinD1蛋白的表达 首先组织块称重并粉碎，配置蛋白裂解液，然后裂解组织样本，加入适当的缓冲液，随后采用 BCA 蛋白测定试剂盒内蛋白的浓度。然后10% SDS-PAGE电泳分离，将蛋白转至PVDF膜上，放置冰浴转膜时间为60 min，之后微型台式真空泵吸尽洗涤液，室温摇动温育2 h 进行封闭，封闭后的滤膜再分别与 CyclinD1 (稀释比为 1∶200) 4 ℃ 温育过夜。选择IgG作为二抗(稀释比为 1∶5 000)，洗膜后使用 beyoECL 发光法显色，自动洗片机洗片，内参采用 GAPDH扫描 X 光片，最后计算灰度值。

2 结果

2.1 术后各组肝组织中CyclinD1mRNA的表达C组在术后第1天CyclinD1mRNA的表达明显高于A组和B组(P<0.05)，之后逐渐降低；B组则在术后的第2天到达高峰，且明显高于另外两组(P<0.05)。术后第3天A组即达高峰，且明显高于其他两组(P<0.05)，而在其他各时间点，A组的表达相对减少，并低于B组和C组(P<0.05，见表1、图1～2)。

表1 肝组织中CyclinD1 mRNA在各个时间点的表达情况(ΔCt)

Tab 1 The expression of CyclinD1 mRNA in every time point(ΔCt)

组别只数术后天数(d)12357A组255．1±0．327．1±0．478．5±0．523．7±0．221．4±0．08B组258．1±0．39∗8．7±0．48∗5．8±0．53∗4．8±0．19∗2．2±0．06∗C组258．9±0．49∗▲7．9±0．51∗▲6．0±0．49∗5．1±0．11∗2．3±0．07∗

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，▲P<0.05。

图1 GAPDH产物电泳图; 图2 CyclinD1的表达

Fig 1 The electrophoresis diagram of GAPDH； Fig 2 The expression of CyclinD1

2.2 术后各组肝组织中CyclinD1蛋白的表达 CyclinD1 蛋白表达水平在三组中的所有时间点均有升高，但C组术后第1天表达就达到高峰，且显著高于另外两组(P<0.05，见表 2、图 3)。

组别例数术后天数(d)12357A组50．162±0．0450．287±0．0360．396±0．0950．492±0．0640．653±0．016B组50．151±0．0450．248±0．0180．336±0．0450．411±0．0240．582±0．089C组50．332±0．069∗▲0．343±0．0260．331±0．0750．343±0．0510．398±0．076

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，▲P<0.05。

图3 Western blotting 检测CyclinD1蛋白表达

Fig 3 The expression of CyclinD1 protein determined by Western blotting

3 讨论

本实验中，注入HB-EGF的部分肝移植小鼠，CyclinD1在 mRNA 和蛋白水平表达均有上调，与对照组比较差异显著，与文献报道[3]一致。表明CyclinD1 蛋白表达的上调，参与了HB-EGF促进肝移植后肝细胞再生的过程。

目前研究[4]表明，肝细胞能否顺利通过细胞周期增殖阶段( G1～S期) ，CyclinD1 起着关键的促进作用，并且作为肝细胞有丝分裂时，进入细胞周期( G1期) 的标识因子。CyclinD1 Pcdk4复合物，能够磷酸化诸多抑制蛋白，比如Rb 和p130 等，以及对于E2F 活化释放，起到诱导作用；而E2F对肝细胞通过G1的控制点起到主要推动作用，并最终进行有丝分裂。肝细胞通过G1后，依赖CyclinD1的调控作用，细胞周期循环将周而复始地进行。众多研究[5]发现CyclinD1对于许多有丝分裂原而言，是主要的关键作用点，如生长因子HGF在活化ERK1/2后，通过激活AP21和NF2κB，从而上调CyclinD1表达[6]，这与本实验的结果一致。

据报道,大鼠部分肝切除术后，CyclinD1 mRNA即开始大量表达，并在术后12 h达到高峰，且其蛋白表达也随之增多，并于第1天表达到达峰值。Mathur等[7]研究证实HB-EGF通过Ras/Raf的途径级联激活MAPK激酶，而MAPK最终能够诱导CyclinD1的表达和活性，支持我们的结果。另外，有研究发现，大鼠肝大部切除后，其再生肝脏组织中HB-EGF、HGF和TGF-α 均有表达，但HB-EGF早于HGF和TGF-α[7-8]，这也与我们的实验结果一致。

我们认为HG-EGF促进肝移植后肝细胞再生的机制可能是诱导Ra的高表达，Ras被激活后，再级联放大激活MAPK。随后被激活的MAPK转至细胞核内，直接激活转录因子。另外，MAPK还可以刺激Fos和Jun 等因子形成转录因子AP-1，并结合myc基因旁的特异的DNA序列，从而启动转录myc基因产物，该转录因子能激活其他基因。最后，这些信号共同诱导CyclinD1的表达，并对肝细胞再生产生促进作用。另外，大鼠部分肝移植后由于凝血紊乱、机体应激等诸多因素的影响，使得很多促肝生长的细胞因子减少甚至消失，导致CyclinD1的表达降低，肝再生延迟，也间接地证明了我们的观点。

[1]Besner G, Higashiyama S, Klagsbrun M. Isolation and characterization of a macrophage-derived heparin-binding growth factor [J]. Cell Regul, 1990, 1(11): 811-819.

[2]Higashiyama S, Abraham JA, Miller J, et al. A heparin-binding growth factor secreted by macrophage-like cells that is related to EGF [J]. Science, 1991, 251(4996): 936-939.

[3]Ongusaha PP, Kwak JC, Zwible AJ, et al. HB-EGF is a potent inducer of tumor growth and angiogenesis [J]. Cancer Res, 2004, 64(15): 5283-5290.

[4]Xia W, Wang XQ. Abstract 3055: Potential role of cyclin D1 in regulation of liver cancer stem cells [J]. Cancer Res, 2014, 74(19 Suppl): 3055-3055.

[5]Pestell RG. New roles of cyclin D1 [J]. Am J Pathol, 2013, 183(1): 3-9.

[6]Varela RM, Fernández RD, Martínez LN, et al. Impaired liver regeneration in mice lacking glycine N-methyltransferase [J]. Hepatology, 2009, 50(2): 443-452.

[7]Mathur A, Martin JF. Stem cells and repair of the heart [J]. Lancet, 2004, 364(9429): 183-192.

[8]Hu J, Srivastava K, Wieland M, et al. Endothelial cell-derived angiopoietin-2 controls liver regeneration as a spatiotemporal rheostat [J]. Science, 2014, 343(6169): 416-419.

(责任编辑：王全楚)

Effects of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor on CyclinD1 of hepatic cell after partial transplantation in rats

ZHOU Lixin, SU Jiqin, WANG Maolin, YAN Huidi, LIN Peiyi

Department of Hepatobiliary Surgery, the NO.2 Hospital of Xiamen, Xiamen 361021, China

Objective To observe effect of using heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor (HB-EGF) on the expression of CyclinD1 of hepatic cell after partial transplantation in rats so as to explore its mechanism．Methods The Two-cuff technique was adopted firstly to construct liver transplantation model of rat part (60%), totally 75 rats. The receptors were divided averagely and randomly into 3 groups: group A, B and C. Then 100 mg/kg the 0.9% NaCl (group A), 100 mg/kg HGF (group B) and 100 mg/kg HB-EGF (group C) were administered, respectively. All groups were done once a day. Subsequently, 5 receptors rats died for each group on the 1st, 2nd, 3rd, 5th and 7th days after the operation. Real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting were used to detect expressions of CyclinD1 mRNA and protein in the hepatic tissue. Results The expression of CyclinD1 mRNA in liver tissue peaked in group C, was higher than other groups on the 1st day after operation. The expression of CyclinD1 protein was increased in 3 groups, but that in the group C was higher than that in other two groups on the 1st day．Conclusion HB-EGF can promote liver regeneration after partial liver transplantation in rats. The mechanism may be related with the increase of CyclinD1 mRNA and protein．

Heparin binding epidermal growth factor like growth factor; Partial liver transplantation; Regeneration; CyclinD1

厦门市科技计划指导性项目(3502Z20139012)

周立新，博士，主任医师，博士生导师，研究方向：肝胆外科临床及基础研究。E-mail：zhoulix318@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.015

R575

A

1006-5709(2016)11-1267-03

2016-05-10