FTO在非酒精性脂肪性肝病患者肝组织中的表达及意义

吴 雪， 马圆圆， 刘晓钢， 李 珊， 张丽侠， 郑丽丽

1.郑州大学第一附属医院内分泌科, 河南 郑州450052; 2.河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室

FTO在非酒精性脂肪性肝病患者肝组织中的表达及意义

吴 雪1,2， 马圆圆1， 刘晓钢1， 李 珊1， 张丽侠1， 郑丽丽1

1.郑州大学第一附属医院内分泌科, 河南 郑州450052; 2.河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室

目的 研究非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)患者肝穿刺组织中脂肪量与肥胖相关基因(fat mass and obesity associated gene, FTO)的表达，探索FTO在NAFLD发生、发展中的作用。方法 免疫组化SP二步法检测肝穿刺组织中FTO蛋白表达，并回顾性分析临床生化指标及肥胖、胰岛素抵抗等相关参数。结果 正常对照组、非酒精性单纯性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver, NAFL)组、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)组均有FTO蛋白表达。与正常对照组相比，NAFL和NASH组中FTO蛋白明显升高，差异有显著统计学意义(P<0.001)；且NASH和NAFL组糖、脂代谢及肥胖参数等与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。结论 FTO可能通过干扰机体糖、脂代谢、增加胰岛素抵抗参与NAFLD的发生、发展。

肥胖相关基因；肥胖；非酒精性脂肪性肝病

近年来，随着我国国民经济的快速发展，人民的饮食结构及生活方式也随之发生了非常大的改变，肥胖人群数量迅速增多，而在肥胖人群中，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的发病率高达75%，初步估计在全球范围内NAFLD人群所占比例可能达到15%～30%[1]。脂肪量与肥胖相关基因(fat mass and desity associated gene,FTO)是近年来第一个被明确与肥胖有极为密切关系的新候选基因[2]。大量研究结果显示FTO与代谢综合征、2型糖尿病、冠心病等多种代谢性疾病相关，是其发病及造成相关死亡的独立危险因素之一[3-7]。而有关FTO与NAFLD的关系及其作用机制的研究相对较少，FTO在NAFLD患者肝脏中如何分布，表达多少及FTO与NAFLD是否相关，目前尚不甚明确。本研究通过免疫组化检测NAFLD患者肝穿刺组织中FTO的表达，同时RT-PCR测定人肝L02细胞肝细胞脂肪变性模型的FTO mRNA表达水平，探讨FTO在NAFLD发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2010年1月-2014年12月在郑州大学第一附属医院消化内科住院治疗并行B超引导下经皮肝穿刺的患者,回顾性分析其临床与病理资料。经影像及组织病理学诊断为NAFLD [均符合中华医学会肝脏病学分会制定的NAFLD诊断及排除标准(2010年版)[8]]的患者，根据NAFLD活动度积分(NAFLD activity score, NAS)将其分为非酒精性单纯性脂肪肝组(nonalcoholic simple fatty liver, NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎组(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)；无脂肪变性和脂肪性肝炎的其他肝病病例作为对照组。NAFLD组与对照组均排除可引起脂肪肝的药物、疾病等[8]。B超引导下经皮肝穿刺由我院临床医师操作完成，标本固定、石蜡包埋、切片及诊断由我院病理科医师完成。

1.2 研究方法

1.2.1 参数记录：回顾性查阅患者病历，记录研究对象的一般资料：年龄、性别、身高、体质量、腰围、臀围，并计算体质量指数[BMI=体质量(Kg) /身高2(m2)]、腰臀比[WHR=腰围(cm) /臀围(cm)]。血清学指标：甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、糖化血红蛋白(HbA1c)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、γ谷酰胺转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、C反应蛋白(CRP)，并计算稳态模式胰岛素抵抗指数[HOMA-IR=FBG×FINS/22.5]、胰岛素敏感性指数[ISI=1/FBG×FINS]。

1.2.2 FTO蛋白检测：免疫组化SP二步法检测肝穿刺组织中FTO蛋白表达。一抗为兔抗人FTO多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，稀释度为1∶300；二抗S-P免疫组化试剂盒、DAB显色液盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；相关操作严格按照说明书进行。以PBS代替一抗作为阴性对照。染色后每张切片随机选择5个视野，以同样的显微镜环境与拍摄条件拍摄照片，采用ImagePro-Plus 6.0专业图像分析软件，测定肝脏FTO染色阳性的累积光密度值(IOD)，取其平均数作为每张切片上FTO蛋白的表达量。

2 结果

2.1 一般资料及血清学指标的比较 正常对照组与NAFL组、NASH组的性别、年龄构成比差异无统计学意义 (P>0.05),具有可比性；与正常对照组相比，NAFL、NASH组患者BMI、WHR、FINS、TG、ALT、AST、GGT、CRP、FTO水平及HOMA-IR显著升高，HDL、ISI降低(P<0.001)；与正常对照组相比，NASH组HbA1c、ALP、LDL、TC升高(P<0.05)；与NAFL组相比，NASH组HDL降低(P<0.05)，LDL、ALT、AST、GGT、BMI升高(P<0.05)，FPG、FIns、HOMA-IR、TG、TC显著升高(P<0.01，见表1)。

正常对照组NAFL组NASH组年龄(岁)37．5±9．238．5±10．337．3±13．8例数(男/女)20(15/5)56(34/22)75(46/29)FTO蛋白7280．20±4149．2523053．24±9901．35b23191．17±14557．71bBMI(kg/m2)21．59±1．6226．09±2．12b27．83±2．28bcWHR0．84±0．020．92±0．05b0．94±0．06bFPG(mmol/L)4．68±0．404．69±0．605．27±0．44bdFINS(mU/L)5．47±0．617．78±2．16b11．49±4．98bdHbA1c(%)4．79±0．325．07±．445．15±0．39aHOMA⁃IR1．14±0．211．63±0．54b2．71±1．29bdISI0．040±0．0060．030±0．009b0．019±0．006bdTG(mmol/L)1．10±0．411．83±0．60b2．57±0．54bdTC(mmol/L)4．08±0．844．41±0．735．20±0．97adHDL(mmol/L)1．24±0．290．94±0．20b0．79±0．12bcLDL(mmol/L)2．46±0．742．68±0．393．26±0．84acALT(U/L)20．30±10．1879．06±35．57b112．94±48．57b，cAST(U/L)19．15±7．59 47．59±29．31b63．44±27．65bcGGT(U/L)19．15±10．7755．65±24．42b85．89±41．95bcALP(U/L)74．85±16．8781．82±25．1794．44±32．72aCRP(mg/L)0．41±0．301．79±1．76b3．54±5．47b

注：与正常对照组比较，aP<0.05，bP<0.001；与NAFL组比较cP<0.05，dP<0.01。

2.2 FTO蛋白表达、组织学定位及其相关关系分析 免疫组化染色结果可见FTO蛋白普遍表达于肝脏，组织学定位主要在肝细胞胞质，少见于细胞核(见图1) ；与正常对照组相比，NAFL及NASH组FTO蛋白阳性表达的累积光密度IOD值明显升高(见表1、图1B～1D)，差异有显著统计学意义(P<0.001)；随着肝脏脂肪变程度的加重[8]，FTO蛋白表达量有升高的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05，见图2)。

图1 FTO在不同组间的表达情况(免疫组化400×) A: PBS代替一抗; B: 正常对照组; C: NAFL组; D: NASH组

Fig 1 The expression of FTO in different groups (Immunohistochemistry 400×) A: PBS instead of primary antibody; B: normal control group; C: NAFL group; D: NASH group

注：与正常对照组相比, #P<0.001，模型组间相比, *P>0.05。

图2 FTO蛋白在不同组间的表达

Fig 2 The expression of FTO in different groups

3 讨论

作为一种与遗传-环境-代谢应激等多种因素相关的疾病，NAFLD与肥胖关系极为密切。环境因素及个体生活行为方式对肥胖的发生有重要影响，而遗传易感性则增加肥胖的发病危险及严重程度[9]。FTO是近年来第一个被明确与肥胖有密切关系的新型候选基因[2]。FTO定位于人类第16条染色体长臂(16q12.2)，该基因片段全长约400 kb,共包含有9个外显子；FTO基因在不同年龄、不同性别人群的多种组织中广泛表达，尤其在下丘脑、垂体、肾上腺等部位高度表达[2]，提示其与能量代谢有一定关系。

目前，FTO与肥胖、NAFLD的关系及其作用机制越来越受到人们的重视。在对不同地域多个人种的独立研究中证实FTO基因的单核苷酸多态性(SNPs)可影响成人及儿童的BMI，增加体质量、体内脂肪量，改变摄食行为等[2]。有研究显示FTO与1型糖尿病无相关性，但是与2型糖尿病存在显著相关性[12]，间接提示FTO与胰岛素抵抗及NAFLD有着紧密联系。Bravard等[11-12]在研究中证实过表达FTO可显著增加脂肪细胞内脂质沉积并引起细胞内活性氧族(ROS)聚集。Guo等[13]在NAFLD大鼠模型中发现其肝组织FTO mRNA及蛋白的表达水平明显升高，并且标志氧化应激水平的丙二醛(MDA)水平升高和抗氧化能力的超氧化物歧化酶(SOD)水平降低；体外细胞实验同样显示在L02肝细胞系中通过质粒转染过表达FTO基因会增加氧化应激并造成肝细胞内脂质沉积。Zhang等[14]进一步证实FTO在NAFLD大鼠肝脏中与叉头转录因子FoxO1表达趋势一致，提示二者具有相关性，发挥协同作用导致NAFLD。

本课题组前期研究发现在NAFLD大鼠肝脏中FTO基因表达增加，且在高脂孵育不同时间长度(24 h、48 h、72 h)的人L02肝细胞中FTO mRNA的表达水平也明显增加[14]。但FTO在NAFLD患者肝脏中是否表达及表达多少、FTO与糖脂代谢等临床指标的关系如何，目前尚无相关报道。本研究通过回顾性分析NAFLD患者临床与病理资料，免疫组化检测其肝穿刺组织中FTO的表达，结合多个临床指标进行统计学分析，探索NAFLD的发病过程。该研究结果显示与对照组相比，NAFLD患者糖、脂代谢及肥胖相关各参数均明显升高，提示FTO可能通过干扰机体糖、脂代谢参与NAFLD的发生、发展；所有NAFLD患者均存在不同程度胰岛素抵抗，且胰岛素抵抗程度随着NAFLD肝脏脂肪变程度的加重而加重，FTO蛋白随肝脏脂肪变加重而表达增加，与本课题组前期实验结果即高脂孵育不同时间长度的L02肝细胞中FTO mRNA在48 h时表达最高的情况基本一致，说明FTO在肝细胞的表达变化与NAFLD的进展显著相关，同时也提示FTO可能通过增加胰岛素抵抗影响肥胖，进而贯穿于NAFLD发病的全过程。但本研究只对高脂孵育的L02肝细胞中FTO mRNA表达水平进行了测定，并未涉及相关作用通路，这是本研究有所局限的方面，但也为以后的临床科研工作指明了方向。

现今有关FTO与NAFLD的研究仍相对甚少，FTO在人体内的作用机制也未完全明了，仍需要我们不断的研究探索，为临床诊治NAFLD及代谢性相关疾病开启一扇新的大门。

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(责任编辑：王全楚)

Expression and significance of FTO in liver tissues of nonalcoholic fatty liver disease

WU Xue1,2, MA Yuanyuan1, LIU Xiaogang1, LI Shan1, ZHANG Lixia1, ZHENG Lili1

1.Department of Endocrinology and Metabolism, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052; 2.Institute of Clinical Medicine Research of Universities Henan, China

Objective To study the expressions of the fat mass and obesity associated gene(FTO) in patients with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), and investigate the role of FTO in the occurrence and development of NAFLD.Methods Immunohistochemical method was used to detect the expression of FTO protein in liver biopsy tissue, the clinical and biochemical indexes and obesity, insulin resistance and related parameters were analyzed.Results FTO protein expressed in normal control group, nonalcoholic simple fatty liver (NAFL) group and the nonalcoholic steatohepatitis (NASH) group. Compared with normal control group, FTO protein was increased significantly in the NAFL and NASH group (P<0.001); in NASH and NAFL groups, the sugar, lipid metabolism and various indexes such as obesity parameters had obvious difference compared with the normal control group (P<0.01).Conclusion FTO may by interfering with the body’s sugar, lipid metabolism, increase insulin resistance to participate in the occurrence and development of NAFLD.

Fat mass and obesity associated gene； Obesity； Nonalcoholic fatty liver disease

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.017

河南省教育厅科学技术研究重点项目(14A320049)

吴雪，医师，硕士，研究方向：糖尿病及血管并发症的发生机制。E-mail:392130952@qq.com

郑丽丽，主任医师。E-mail：zhengli1012@126.com

R575.5

A

1006-5709(2016)11-1275-04

2016-1-5