呢醇X受体、瘦素及髓过氧化物酶在胆管癌中的表达及意义

禹 晶，张秉全，王燕颖，鲍红光，翟雅娟，王文斌，李秀荣

齐齐哈尔医学院附属第二医院 1.消化内科; 2.循环内科；4.肿瘤外科，黑龙江 齐齐哈尔 161006；3.上海市东方医院 消化内科；5.黑龙江省医院病理科

呢醇X受体、瘦素及髓过氧化物酶在胆管癌中的表达及意义

禹 晶1，张秉全2，王燕颖3，鲍红光4，翟雅娟1，王文斌1，李秀荣5

齐齐哈尔医学院附属第二医院 1.消化内科; 2.循环内科；4.肿瘤外科，黑龙江 齐齐哈尔 161006；3.上海市东方医院 消化内科；5.黑龙江省医院病理科

目的 探讨法呢醇X受体(FXR)、瘦素(Lep)及髓过氧化物酶(MPO)在胆管癌组织中的表达变化及意义并分析它们间的关系。方法 采用免疫组织化学染色及Real time-PCR法检测胆管癌组、癌旁无癌胆管组和正常胆管组中FXR、Lep和MPO的表达。结果 FXR、Lep和MPO在胆管癌组、癌旁无癌胆管组和正常胆管组中均有表达。FXR在癌旁无癌胆管组织和正常胆管组织中的阳性表达率显著高于癌组织(P<0.05)，而在癌旁无癌胆管组织与正常胆管组织中，无显著性差异(P>0.05)。Lep和MPO在癌旁无癌胆管组织和正常胆管组织中的阳性表达率显著低于胆管癌组织(P<0.05)，而在癌旁无癌胆管组织与正常胆管组织中，无显著性差异(P>0.05)。FXR蛋白与Lep蛋白之间呈线性相关关系(r=-0.738，P<0.05)，而FXR、Lep与MPO无相关性(P>0.05)。结论 FXR、Lep与MPO可能通过调节脂质代谢平衡及免疫应答等机制共同参与胆管癌的发生和发展，进一步的研究有可能为胆管癌的诊断和治疗提供新的途径。

法呢醇X受体；瘦素；髓过氧化物酶；胆管癌

大量流行病学资料发现,肥胖可影响某些癌症的发生。世界卫生组织的统计数据显示,目前肥胖已成为继吸烟之后的第二大重要致癌因素,最新研究表明肥胖与胆管癌关系密切。法呢醇X受体(farnesoid X receptor，FXR)及瘦素( leptin,Lep)为肥胖相关因子且与肿瘤关系密切，这提示我们，FXR及Lep可能在胆管癌的发生、发展过程中起重要作用。髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)是一种糖蛋白,又是活化多环芳烃类致癌物的代谢酶，具有肿瘤细胞毒作用[1]。本研究即对胆管癌中上述因子蛋白及mRNA的表达进行检测,并分析其关系,为进一步探讨胆管癌的诊治的新靶点提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 收集齐齐哈尔医学院第二附属医院及合作医院上海东方医院2008年-2013年诊断明确、资料完整的胆管细胞癌手术标本47例，所有病例术前均未行放、化疗，选其中20例与上述肿瘤切除标本对应的癌旁无癌胆管组织(切缘距肿瘤的距离为1 cm)及 13例正常胆管组织。胆管癌组织学缺乏统一的分类，常用的是按癌细胞类型分化程度分为3型：(1)高分化腺癌：在胆管癌中最多，可占2/3以上。癌组织呈形状不规则的腺体结构，有的可扩大呈囊腔。(2)低分化腺癌：即分化差的腺癌，癌组织部分呈腺体结构，部分为不规则的实性片块。(3)介于两者间为中分化癌[2]。47例胆管细胞癌中，高分化癌20例，中分化癌15例，低分化癌12例，男28例，女19例，年龄51～81岁，平均(70.32±1.56)岁；20例癌旁无癌胆管组织中，男12例，女8例，年龄24～70岁，平均(50.43±2.36)岁；13例正常胆管组织中，男8例，女5例，年龄41～68岁，平均(62.73±2.09)岁。将标本置液氮速冻后-70 ℃保存备用。鼠抗人抗体FXR、Lep及MPO均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；免疫组化试剂盒及DAB显色剂购自福州迈新生物技术有限公司。细胞总RNA提取试剂Tripure (Roch公司),SYBRGreen PCR MasterMix (Applied Biosystems公司),M-MLV逆转录酶(Invitrogen公司),SDS-PAGE试剂盒(北京中彬公司)，TAKARA PrimeScriptTMrt-PCR Kit 试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 二步法免疫组化检测方法：石蜡包埋组织连续切片厚度 3 μm，按免疫组化要求处理。常规脱蜡至水，经30 ml/L H2O2室温下浸泡15 min，以灭活内源性酶。0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液微波抗原修复20 min，取出冷却。 PBS冲洗后切片分别滴加一抗(鼠抗人抗体FXR、Lep及MPO，室温下孵育1 h，PBS冲洗后滴加通用型IgG抗体(Fab段)-HRP多聚体溶液，室温湿盒中放置15 min，PBS冲洗后应用DAB显色5～10 min，苏木素复染后，脱水透明封片，光镜下观察。

1.2.2 Real time-PCR法检测FXR、Lep、MPO及GAPDH mRNA表达：提取RNA：将标本组织匀浆，用Tripure试剂提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA质量和浓度。逆转录反应：参照 TAKARA PrimeScriptTMRT-PCR Kit 试剂盒操作说明书进行，获得 cDNA。PCR 扩增：FXR上游引物：5′-CCTGGATTTCTTCTGGACATT-3′，下游引物：5′-GGACCTGCCACTTGTTCTGT-3′；扩增片段长度 170 bp；Lep上游引物：5′-GACTTCATTCCTGGGCTCCACC-3′，下游引物：5′-CCTGAAGCTTCCAGGACACC-3′；扩增片段长度145 bp；MPO上游引物：5′-TCCCTTTCATCCTCCTATCT-3′，下游引物：5′-CTGACCTCAACTAATCCACT-3′；扩增片段长度 196 bp；内参照GAPDH 上游引物：5′-GCAAATTCCATGGCACCG-3′，下游引物 ：5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′,扩增片段 160 bp。反应条件:FXR及GAPDH样品预变性94 ℃ 5 min (94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min)×40个循环,延伸72 ℃ 10 min；Lep样品预变性95 ℃ 5 min (94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)×40个循环,延伸72 ℃ 10 min；MPO样品预变性95 ℃ 5 min (94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)×40个循环，延伸72 ℃ 10 min。

1.3 染色结果判定[3]以上步骤中，以PBS代替一抗为阴性对照，已知阳性切片为阳性对照。每例随机观察5个视野，每个视野取100个细胞，计数500个细胞中染色阳性细胞数，阳性细胞数<5%为阴性(-)；阳性细胞数5%～25%为弱阳性(+)；阳性细胞数25%～50%为中等强度阳性(++)；阳性细胞数>50%为强阳性(+++)。

2 结果

2.1 胆管细胞癌、癌旁无癌胆管组织及正常胆管组织中FXR、Lep及MPO的阳性表达 FXR均表达于细胞浆，以胞浆内出现棕黄色或棕色颗粒为阳性；MPO阳性染色主要位于胞浆呈棕褐色颗粒状；Lep在细胞浆中可见棕黄色和/或黄色着色颗粒,阳性颗粒分布不均匀,多呈散在片状或灶状分布，细胞核未见阳性细胞染色。FXR在正常胆管组织和癌旁无癌胆管组织的阳性表达率分别为69.23%和65.00%,高于癌组织55.32%(P<0.05，见图1)，而在癌旁无癌胆管组织与正常胆管组织中，阳性表达率无显著性差异(P>0.05)；Lep在正常胆管组织和癌旁无癌胆管组织的阳性表达率分别为30%和40%低于癌组织70.21%(P<0.05，见图2)，而在癌旁无癌胆管组织与正常胆管组织中，阳性表达率无显著性差异(P>0.05，见表1)；MPO在正常胆管组织和癌旁无癌胆管组织中的阳性表达率分别为30.77%和35.00%低于癌组织68.19%(P<0.05)，而在癌旁无癌胆管组织正常胆管组织中，阳性表达率无显著性差异(P>0.05，见图3、表1)。

图1 胆管细胞癌组织中FXR 的表达(苏木素HE 100×)；图2 胆管细胞癌组织中Lep的表达(苏木素HE 100×)；图3 胆管细胞癌组织中MPO的表达(苏木素HE 100×)
Fig 1 The expression of FXR in the bile duct cancer tissue (HE 100×); Fig 2 The expression of Lep in the bile duct cancer tissue (HE 100×); Fig 3 The expression of MPO in the bile duct cancer tissue (HE 100×)

2.2 FXR、Lep和MPO蛋白表达的联合分析结果 FXR蛋白与Lep蛋白在胆管癌组织中的表达有协同变化的趋势，两者呈线性相关关系(r=-0.738，P<0.05，见表2)；而MPO蛋白与FXR、Lep蛋白在胆管癌组织中的表达均无相关性(P>0.05)。

表1 FXR、Lep及MPO在胆管细胞癌、癌旁无癌胆管组织及正常胆管组织中的阳性表达Tab 1 The positive expressions of FXR,Lep and MPO in the bile duct cancer tissue,adjacent non-cancer tissue and the normal bile duct tissue

表2 FXR、Lep蛋白在胆管细胞癌组织中的表达的变化趋势Tab 2 The tendency of FXR,Lep protein in the bile duct cancer tissue

2.2 FXR mRNA、Lep mRNA和MPO mRNA的表达 胆管细胞癌、癌旁无癌胆管组织及正常胆管组织中FXR mRNA、Lep mRNA和MPO mRNA均有表达，FXR mRNA在癌旁无癌胆管组织和正常胆管组织中的表达高于癌组织，而Lep mRNA及MPO mRNA在癌旁无癌胆管组织和正常胆管组织中的表达低于癌组织，差异均有统计学意义 (P<0.05，见图4)。

注：与正常胆管组比较，*P<0.05。

图4 胆管细胞癌、癌旁无癌胆管组织及正常胆管组织中FXR mRNA、Lep mRNA和MPO mRNA的表达
Fig 4 The mRNA expressions of FXR，Lep and MPO in the bile duct cancer tissue,adjacent non-cancer tissue and the normal bile duct tissue

3 讨论

胆管癌是一种源于肝内或肝外胆道上皮，具有较高侵袭性的恶性肿瘤[4]。研究发现近年来胆管癌发病率有所上升，其起病隐匿，早期诊断率低，严重威胁人类的健康[5]，临床上对该疾病越来越重视，因此深入研究胆管癌发病机制，并寻求有效的诊治新靶点显得尤为重要。

流行病学调查显示在肥胖人群中癌症的患病风险明显增加，其具体机制目前仍然不清，可能与肥胖相关的炎症因子过度释放相关。世界多个研究[6]中心对肥胖与肿瘤发生、发展的相关性进行了大量的调查研究，结果表明肥胖是胆管癌发生的危险因素之一。肥胖是由脂肪组织增多引起的，它可以分泌包括激素、生长因子、细胞因子等多种物质，它们在代谢调节、免疫、血管生成等过程中起重要作用[7]。Lep是由脂肪组织细胞特异性分泌的一种细胞因子，而FXR在脂肪组织细胞中却表现为低表达，二者均为肥胖相关因子，这提示FXR及Lep可能通过调节脂质代谢平衡等机制共同参与胆管癌的发生和发展，有利于阐明胆管癌的发病机制和病理生理过程，可能为胆管癌的诊疗提供新的靶点。

FXR是参与人体代谢等多种功能调节的细胞核内受体，在胆汁酸及脂质代谢等方面发挥重要作用，近年来随着研究的深入，发现其表达对于调控结肠及肝脏等肿瘤的发生、发展也具有重要意义。研究发现FXR 可抑制多种炎症因子如核因子-κB(NF-κB)等的表达,而这些炎症因子都是促进癌细胞生长的重要因素；在肝癌中，FXR 可抑制NF-κB 的活性，从而诱导癌细胞凋亡[8]。De Gottardi等[9]通过定量RT-PCR方法检测了60例结肠腺瘤及结肠癌患者的FXR表达情况，发现与正常结肠黏膜相比，结肠腺瘤中FXR的表达较低，而结肠癌中更为明显地降低，其中Ⅰ期和Ⅳ期肿瘤的FXR表达量分别下降为6.9%和3.3%，统计学表明FXR表达水平与结肠肿瘤分期有相关性，差异有统计学意义。本研究发现FXR 在胆管癌组、癌旁胆管组和正常胆管组中均有表达，以正常胆管组表达强度最高，癌旁胆管组次之，胆管癌组最低，其中正常胆管组和癌旁胆管组中FXR 的表达无明显差异，而在癌组织中表达却显著降低，差异有统计学意义。这提示FXR或许有抑癌作用，可能通过某一机制在抑制胆管癌的形成中起着重要作用,因此FXR在基础和临床的研究中具有越来越重要的作用，这也将开辟FXR调控网络的新领域。

Lep是由脂肪细胞合成并分泌的细胞因子样激素，其作为一个多功能的细胞因子，不但参与糖脂代谢等过程的调节，而且参与了机体内许多细胞功能。有研究证实，Lep可抑制肿瘤细胞的凋亡,促进其增殖,调节机体免疫及促进血管形成[10]。如在肝细胞中，Lep可引起肝细胞免疫功能失调，对肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)敏感度增高，最终导致肝细胞毒性增加。Ramani等[11]研究表明，在人类肝癌细胞系HepG2和Huh7中，Lep具有促癌细胞增殖作用，并增加癌细胞的侵袭能力和迁移能力，说明Lep与肝癌的发生有关。本研究也发现Lep在胆管癌组、癌旁胆管组和正常胆管组中均有表达，以胆管癌组表达强度最高，癌旁胆管组次之，正常胆管组最低，其中正常胆管组和癌旁胆管组中Lep的表达无明显差异，而在癌组织中表达却显著降低，差异有统计学意义。这提示Lep有促癌作用，它可以通过与相应受体结合，通过不同的信号传导通路发挥病理生理作用，但其具体的信号传导通路仍需进一步深入研究。

MPO是中性粒细胞中嗜天青颗粒经氧化反应后所产生的一种极其重要的过氧化物酶，主要存在于嗜中性粒细胞和单核细胞中[12]。MPO氧化作用的过度表达被认为与组织损伤和疾病的起始、进展相关。比如,起源于慢性炎症的癌症。同时MPO氧化活性被认为促进了化学致癌物质代谢,导致了DNA损伤和修复过程[13]。Jaganjac 等[14]研究表明MPO在肿瘤微环境的表达是肿瘤细胞转移后伴随着丙烯醛而出现的，并在肿瘤细胞衰退期间表达增强。研究发现MPO可产生自由基,可有效防止自然杀伤细胞对肿瘤细胞的对抗反应，同时导致受损DNA堆积,这也可能是间接地促进肿瘤细胞的发生和发展的原因之一[15]。本实验中MPO在胆管癌组、癌旁胆管组和正常胆管组中均有表达，以胆管癌组表达强度最高，癌旁胆管组次之，正常胆管组最低，其中正常胆管组和癌旁胆管组中MPO的表达无明显差异，而在癌组织中表达却显著降低，差异有统计学意义。这提示MPO与胆管癌有相关性。在胆管癌中MPO可能通过化活性导致了DNA损促进了胆管癌的发生。

随着对脂肪组织功能的不断深入研究，FXR及Lep等脂肪相关因子已陆续被发现，脂肪相关因子与肿瘤的相关性研究，已成为肥胖与肿瘤发生、发展相关性研究中的重要“桥梁”。 目前有报道称这两种因子在肿瘤发生、发展的不同阶段有不同的作用[16]。综上所述，本研究初步证实了FXR及Lep可能共同通过脂质代谢及免疫应答等途径参与胆管癌的发生、发展，但其细胞内信号通路还未完全阐明，二者可否作为胆管癌的标志物乃至未来治疗的潜在靶点，还需要做更深入的研究。但二者与MPO无相关性提示FXR、Lep及MPO可能通过多种机制共同参与了胆管癌的发生、发展，这为胆管癌的研究增加了难度但同时也让我们开阔了胆管癌诊疗的多方向性。

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(责任编辑：李 健)

The expression and significance of farnesoid X receptor,leptin and Myeloperoxidase in cholangiocarcinoma

YU Jing1,ZHANG Bingquan2,WANG Yanying3,BAO Hongguang4,ZHAI Yajuan1,WANG Wenbin1，LI Xiurong5

1.Department of Gastroenterology; 2.Depatment of Vasculocardiology; 4.Department of Oncological Surgery,the Second Affiliated Hospital of Qiqihaer Medical College,Qiqihaer 161000; 3.Department of Gastroenterology,Easter Hospital of Shanghai; 5.Department of Pathology,Heilongjiang Provincial Hospital,China

Objective To investigate the farnesoid X receptor (FXR),leptin (LEP) and myeloperoxidase (MPO) expression in bile duct cancer and to analyze the relationship between them.Methods The expressions of FXR,Lep and MPO in the bile duct cancer group,adjacent non-cancer group and the normal bile duct group were detected by immunohistochemical staining and Real time PCR method.Results FXR,Lep and MPO in the bile duct cancer group,adjacent non-cancer group and the normal bile duct group were expressed,the positive expression rate of FXR in the adjacent non tumor margin and normal bile duct tissues were significantly higher than bile duct carver tissue (P<0.05),while in the adjacent non tumor margin and normal bile duct tissues,there was no significant difference (P>0.05). The rate positive expression of Lep and MPO in the adjacent non tumor margin and normal bile duct tissues was significantly lower than bile duct cancer tissue (P<0.05),and in the adjacent non tumor margin and normal bile duct tissues,there was no significant difference (P>0.05). There was linear correlation between FXR and Lep (r=-0.738,P<0.05). While there is no correlation between FXR,Lep and MPO (P>0.05).Conclusion FXR,LEP and MPO can regulate lipid metabolism balance and immune response mechanisms involved in the occurrence and development of bile duct carcinoma,further research may provide a new way for the diagnosis and treatment of bile duct cancer.

The farnesoid X receptor; Leptin; Myeloperoxidase; Bile duct cancer

黑龙江省齐齐哈尔市科学技术计划项目(sfzd-2012033)

禹晶，硕士，副主任医师，研究方向：消化系统肿瘤的早期诊断及机制研究。E-mail:hljzbq@163.com

王燕颖，博士，主任医师，研究方向：消化系统肿瘤的早期诊断及机制研究。E-mail:yanyingwang1972@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.02.027

R735.8

A

1006-5709(2016)02-0215-04

2014-06-11