唐古特大黄多糖组分1 对大鼠急性放射性肠损伤的保护作用

刘琳娜，张 甜，石 磊，张志培，李诗草，关 波，张文娟

第四军医大学唐都医院药剂科，陕西 西安710038

放射性肠炎(radiation enteritis，RE)是腹盆腔及腹膜后肿瘤放疗后最为常见、也最棘手的并发症之一。RE 发生后，患者出现严重的腹痛、腹泻、便次增多、黏液脓血便甚至鲜血便，加重患者的恶病质而影响疗效，严重时甚至导致患者死亡，因此临床上必须重视，严防发生［1］。但目前尚无特异性的针对RE 的有效预防药物［2］。

本实验室从唐古特大黄中提取、分离得到水溶性多糖，并经凝胶柱层析分离得到5 个不同分子量组分的大黄多糖(Rheum tanguticum polysaccharides，RTP 1-5)，动物实验表明，RTP1［分子量(6 ～8)×105］能明显降低2，4，6-三硝基苯磺酸诱导的结肠炎大鼠的死亡率，减轻结肠重量，缩小溃疡面积，缓解黏膜水肿［3］;对正常大鼠小肠隐窝细胞IEC-6，RTP1 可通过清除多胺，使鸟氨酸脱羧酶(ODC)活性增高及蛋白表达增加促进肠上皮细胞的增殖、移行和分化［4］;以其预处理细胞后，可减少过氧化氢诱导的肠上皮细胞凋亡，增强细胞活力［5］，但RTP1 对辐射肠损伤的作用尚不明确，本实验通过建立大鼠急性肠辐射损伤模型，观察RTP1对射线所致肠黏膜损伤的防护作用，为寻找新的、具有放射性肠损伤保护作用的药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器 近交系成年雄性SD 大鼠，体质量220 ～250 g［动物合格证号:SCXK(军)第2012-0007 号］，由第四军医大学实验动物中心提供。RTP1 采用水提醇沉法得到粗多糖，之后分别经DEAE-52 柱(上海锐谷生物科技有限公司)层析、Sephacryl S-200 凝胶柱(GE China-Healthcare)层析分离纯化后，得到多糖组分1(RTP1)。使用前将RTP1以PBS 溶液(pH 7.4)溶解。还原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，内毒素、二胺氧化酶(DAO)及D-乳酸酶联免疫试剂盒均购自上海卓康生物公司;Varian Clinac 23EX 医用直线加速器，LEICA普通光学显微镜，Leica 图像分析仪、722 型光栅分光光度计。

1.2 急性放射性肠炎动物模型的制作 大鼠禁食12 h 后以戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定于自制木质鼠板上，以6 MV 直线加速器行X 射线全腹部(剑突下至耻骨联合)照射，源皮距80 cm，照射剂量10.0 Gy，剂量率4.0 Gy/min，制作稳定的、适合研究用的SD 大鼠急性放射性肠炎模型。

1.3 动物分组及处理 60 只SD 雄性大鼠随机分为5 组:(1)单纯照射组(IC 组);(2)正常对照组(灌胃给予PBS，连续7 d);(3)RTP1 高剂量组(灌胃给予RTP1 800 mg/kg，连续7 d);(4)RTP1 中剂量组(灌胃给予RTP1 400 mg/kg，连续7 d);(5)RTP1 低剂量组(灌胃给予RTP1 200 mg/kg，连续7 d)，给药结束后上述各组动物均接受10.0 Gy 6 MV 高能X 射线单次腹部照射1 次;照射结束后第3 天禁食12 h，进行指标检测。

1.4 检测指标

1.4.1 肠黏膜病理组织学改变:大鼠处死后，即刻取距屈氏韧带10 cm 处2 cm 小肠标本，40 g/L 中性甲醛溶液固定，6 μm 厚石蜡切片，HE 染色，光镜下观察肠黏膜形态结构;用Leica 图像分析仪分别随机全盲测定3 张非连续切片各10 个绒毛数量和高度，绒毛高度为从长绒毛基部到顶端的长度，取其均值［6］。

1.4.2 肠屏障功能障碍指标:无菌状态下心脏穿刺取血5 ml，3 000 r/min 、4 ℃离心10 min，取血浆，-20℃保存，以酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆中DAO、D-乳酸及内毒素含量。

1.4.3 肠组织氧化还原酶GSH、SOD、MDA 活性测定:取末端回肠组织4 cm，用预冷的生理盐水冲洗，滤纸吸干称重，置玻璃匀浆管中，加入冷生理盐水，以20 000 r/min 匀浆10 s，间歇30 s，反复进行3 次，制成10%组织匀浆，4 000 ×g 离心15 min 取上清，分别按照GSH、SOD、MDA 试剂盒说明书进行检测。

1.5 统计学处理 采用SPSS 10.0 统计软件进行处理，实验数据以s 表示，统计方法使用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较使用q 检验，检验水平(α)为0.05，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RTP1 对辐射大鼠肠黏膜组织病理形态改变实验结果表明，IC 组大鼠全部出现腹泻，排不成形含大量水和黏液的稀便，稀便率为100%，同时大鼠出现不同程度的精神萎靡、皮毛色泽下降、肛门周围污浊等，且体质量下降;正常对照组则体质量继续增长，RTP1 预处理组3 d 后，大便形状有一定改善，黏液较少，但与正常组比仍较湿软，对正常对照组大鼠进行解剖后发现，肠管呈粉红色，无充血、水肿、肠腔扩张，光镜下观察发现，该组大鼠小肠黏膜绒毛排列整齐、紧凑，轮廓清晰，表面结构完整，绒毛高度和隐窝深度均较大;IC 组大鼠肠管呈暗红色，肠腔扩张、充血，肠壁变薄、黏膜出血，甚至有溃疡和穿孔，光镜下观察则可见小肠黏膜上皮广泛剥脱、坏死，绒毛明显萎缩变短、变秃，且排列杂乱、无序，表面结构不完整，有广泛的破损现象;RTP1 预处理组肠黏膜情况明显好于IC 组，肠腔扩张、肠黏膜充血明细减轻，光镜下观察也可发现，小肠黏膜绒毛排列较为整齐和有序，绒毛虽然也有萎缩，但与IC 组相比程度较轻(见图1)。各组大鼠小肠绒毛高度和绒毛数量测量结果:与正常对照组比较，IC组小肠绒毛高度和数量均明显下降(P ＜0.05);RTP1各组绒毛的高度和宽度略有下降，高剂量组绒毛的高度与正常对照组比较无明显差异，与IC 组比较差异有统计学意义(P ＜0.05);中、低剂量组绒毛高度和宽度虽较IC 组高，但差异无统计学意义(P ＞0.05，见表1)。

表1 RTP1 对辐射大鼠小肠绒毛高度和隐窝深度的影响(s)Tab 1 Effects of RTP1 on villus height and crypt depth after radiation (s)

表1 RTP1 对辐射大鼠小肠绒毛高度和隐窝深度的影响(s)Tab 1 Effects of RTP1 on villus height and crypt depth after radiation (s)

注:与正常对照组相比，* P ＜0. 01;与IC 组相比，●P ＜0.05，▲P ＜0.01。

组别 例数照射组绒毛高度(μm) 隐窝深度(μm)12 322.70 ±16.54 121.20 ±18.24 IC 组 12 108.33 ±13.96* 47.11 ±5.86*RTP1 高剂量组 12 304.35 ±22.53▲ 71.98 ±10.71▲RTP1 中剂量组 12 281.74 ±41.32▲ 61.37 ±10.58▲RTP1 低剂量 12 127.12 ±12.91● 53.33 ±11.72正常对照组●

2.2 大鼠血浆中DAO、D-乳酸及内毒素检测结果IC 组血浆DAO、D-乳酸及内毒素含量均较正常对照组高(P ＜0.05)，且DAO、D-乳酸与内毒素的含量变化呈正相关;以RTP1 预处理后，各剂量组血浆DAO 及D-乳酸均显著降低(P ＜0.05)，内毒素含量也低于IC 组(P ＜0.05)，低剂量组虽然也有降低血浆内毒素含量的趋势，但与IC 组比较，差异无统计学意义(P ＞0.05，见表2)。

图1 光镜下各组大鼠小肠黏膜膜形态观察(HE 染色) A:正常对照组，小肠黏膜绒毛排列整齐、上皮细胞形态正常，未见黏膜充血、水肿及炎细胞浸润等表现;B:IC 组，大鼠小肠黏膜绒毛稀疏、萎缩，黏膜水肿，其腺隐窝深度和绒毛高度均较正常对照组显著减少;C:RTP1 高剂量组大鼠腺隐窝深度、肠黏膜厚度和绒毛高度均较IC 组明显增加Fig 1 Representative images showed height of villi and crypt cell survival in the intestinal circumference of different groups (HE staining) A:the control group had neat and compact mucosa villi，and their small intestinal villi had a clear outline. There was no mucosal hyperemia and edema and inflammatory cell infiltration;B:the small intestinal mucosa epithelium of the rats in the IC group was stripped，shortened，disorderly and necrotic. The villus height and crypt depth were significant decreased compared with IC group;C:in the RTP1 high dose group，the thickness of intestinal mucosa，villus height and crypt depth were significant increased compared with IC group

表2 RTP1 对大鼠血浆中DAO、D-乳酸及内毒素含量的影响(s)Tab 2 Effect of RTP1 on DAO，D-lactate and endotoxin levels in blood plasma (s)

表2 RTP1 对大鼠血浆中DAO、D-乳酸及内毒素含量的影响(s)Tab 2 Effect of RTP1 on DAO，D-lactate and endotoxin levels in blood plasma (s)

注:与正常对照组相比，* P ＜0.01;与IC 组相比，▲P ＜0.05，●P ＜0.01。

组别 例数 DAO(U/L) D-乳酸(U/L) 内毒素(EU/L)12 42.28 ±6.98 15.68 ±4.91 0.023 ±0.004 IC 组 12 97.34 ±13.65* 59.48 ±9.78* 0.067 ±0.071*RTP1 高剂量组 12 63.22 ±8.98● 30.56 ±8.45● 0.036 ±0.012●RTP1 中剂量组 12 78.52 ±7.89● 34.89 ±9.77● 0.031 ±0.009●RTP1 低剂量组 12 88.56 ±6.98▲ 42.81 ±7.32▲正常对照组0.059 ±0.006

2.3 肠组织中GSH、SOD、MDA 含量变化 与正常对照相比，IC 组大鼠小肠组织中MDA 含量均显著升高(P ＜0.05)，GSH 含量及SOD 活性显著降低(P ＜0.05)。与IC 组比较，RTP1 高剂量组和中剂量组GSH、MDA 含量显著降低(P ＜0. 05)，GSH 含量及SOD 活性明显升高(P ＜0.05)，低剂量组MDA 含量变化不显著，与IC 组比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)，但SOD 活性与IC 组比较，差异有统计学意义(P ＜0.05，见表3)。

表3 RTP1 对大鼠小肠组织GSH、SOD、MDA 水平的影(s)Tab 3 Effect of RTP1 on the SOD activity，MDA content and GSH activity in the intestine of rats after radiation (s)

表3 RTP1 对大鼠小肠组织GSH、SOD、MDA 水平的影(s)Tab 3 Effect of RTP1 on the SOD activity，MDA content and GSH activity in the intestine of rats after radiation (s)

注:与正常对照组相比，* P ＜0.01;与IC 组相比，●P ＜0.05，▲P ＜0.01。

组别 例数 GSH(nmol/mg) SOD(mU/mg) MDA(nmol/mg)

3 讨论

肠道上皮细胞增殖迅速，是除骨髓之外对辐射最为敏感的细胞，射线导致肠隐窝上皮细胞增殖抑制、凋亡和坏死，从而使小肠绒毛高度降低、黏膜萎缩，肠黏膜屏障损伤，细菌移位和内毒素血症［7］。本研究证实，RTP1 对2，4，6-三硝基苯磺酸、过氧化氢所致肠黏膜损伤具有一定的保护作用，但RTP1 对辐射肠黏膜损伤是否具有保护作用尚不明确。

肠黏膜屏障功能的状况是诊断肠黏膜屏障功能障碍的重要依据，临床上常用的方法如血中D-乳酸检测、血浆内毒素检测及DAO 检测等［8］。肠黏膜细胞受损伤后，细胞间的紧密连接被破坏，肠通透性增加，D-乳酸作为肠道多种细菌均可产生的发酵代谢产物，是肠屏障功能损害、肠通透性增加的有效预警指标，DAO是大部分存在于小肠黏膜绒毛中的细胞内酶，其活性与绒毛高度和黏膜细胞内的核酸与蛋白质合成密切相关，是反映小肠黏膜结构与功能的理想指标，外周血中内毒素水平也是评价肠屏障功能的重要手段，当肠屏障发生功能障碍时，肠道中的内毒素穿过破损的肠黏膜进入血液循环，严重时甚至形成内毒素血症。

本研究采用6 MV 直线加速器进行总剂量10 Gy X 射线单次照射的方式建立急性大鼠SD 模型，大鼠肠管肠腔扩张、充血，肠壁变薄、黏膜出血、甚至有溃疡和穿孔，光镜下可见肠绒毛明显变短、结构紊乱，同时血浆中DAO 活性和D-乳酸浓度均明显升高，且与内毒素的浓度变化具有良好的相关性，当给予RTP1 预处理后，RTP1 预处理组肠黏膜情况明显好于单纯照射组，肠腔扩张、肠黏膜充血明显减轻，光镜下观察也可发现，小肠黏膜绒毛排列较为整齐和有序，绒毛虽然也有萎缩，但与IC 相比程度较轻，绒毛高度和隐窝深度均较模型组有一定改善，血浆中DAO 活性、D-乳酸浓度及内毒素水平均降低，表明肠黏膜屏障得到一定保护。

氧自由基损伤是辐射所致肠黏膜损伤的最主要因素［9］，SOD 是机体内清除氧自由基的重要酶之一，其活力和含量反映了机体清除氧自由基的能力，SOD 是重要的抗氧化酶，此酶能清除超氧阴离子自由基()，保护细胞免受损伤，保护肠道免受辐射损伤的影响，MDA 是脂质过氧化的最终产物，其含量可直接反映组织脂质过氧化程度，测试MDA 的量常可反映脂质过氧化的程度，间接反映细胞受损伤的程度，GSH在清除ROS、维持组织细胞的氧化还原平衡中发挥重要作用，本实验结果发现，辐射后大鼠小肠组织中SOD 活性及GSH 含量明降减低、MDA 含量明显升高，RTP1 预处理后可以拮抗以上改变，说明大鼠接受10.0 Gy X射线单次腹部照射后小肠组织细胞内氧化还原酶平衡遭到破坏，RTP1 可通过其抗氧化性清除ROS，保护肠黏膜免受损伤，从而降低肠通透性，使得肠黏膜得以保存结构和功能的相对完整。

综上所述，RTP1 可在一定程度上保护肠黏膜免受辐射损伤，胃肠肠黏膜屏障的功能，该作用的发挥可能与其减轻脂质过氧化损伤有关，但具体作用机制尚需进一步探讨。

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