丹参多酚酸盐注射液对实验性结肠炎小鼠血清脂肪因子水平的影响

蒋晓芸，戎 兰，蒋义斌，钟 良，孙大裕

复旦大学华山医院消化科，上海200042

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn's disease，CD)，其发病机制及病因至今未明。研究表明，许多脂肪细胞因子是炎症相关蛋白质，参与IBD 的发病，其中脂联素(adiponectin)、趋化素(chemerin)、瘦素(leptin)可能发挥重要作用。本文首次采用丹参多酚酸治疗小鼠实验性结肠炎，观察其疗效，并研究其对脂肪因子的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性BALB/C 小鼠30 只，清洁级，购于国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心，6 ～8 周龄，平均体质量(21.350 ±1.334)g。分子量5 000 DSS(Sigma 公司，批号:BCBD6951V)。丹参多酚酸盐注射液由上海绿谷制药有限公司提供，批号:09118(丹参乙酸镁含量99.04%)。脂联素、趋化素、瘦素酶免试剂盒由RD 公司出品，批号20110601A。XW-80A 旋涡振荡器(上海青浦泸西仪器厂)，K10CD 干式恒温器(杭州蓝焰科技有限公司)，BDC-280e 冷藏冰箱(伊莱克斯，湖南长沙)，1-15K 3K15 低温冷冻离心机(美国Sigma)，ZXC 型紫外杀毒车(上海跃进医用光学器械厂)，OlympusBH2 显微镜，Nikon 4500 数码相机。

1.2 方法

1.2.1 造模:每日制备5% DSS 溶液，供对照组外所有小鼠自由饮用，不再予其他饮水，7 d 可造成急性肠炎模型。

1.2.2 小鼠分组及处理:30 只小鼠随机分为对照组、模型组、丹参多酚酸盐干预组，每组10 只。对照组:每天予正常饮水。模型组:造模同时予生理盐水腹腔注射2 周。丹参多酚酸盐干预组:造模同时每日予丹参多酚酸盐腹腔注射240 mg/kg 2 周。处死前称重，眼球采血，3 000 r/min 离心，吸取血清后分装-20 ℃深低温冰箱冻存备用。开腹，取肛门1 cm 处以上病变明显处组织标本(约5 mm×10 mm)，部分予40 g/L 中性甲醛固定，石蜡包埋，切片HE 染色观察肠黏膜形态。

1.2.3 观察:造模过程中观察小鼠便血情况。

1.2.4 组织病理学评分:HE 染色切片观察肠黏膜形态。评分标准按Coopers HS 组织评分，前3 项评分相加后与第4 项的乘积为组织学评分。

1.2.5 血清脂联素、趋化素、瘦素:取深低温冰箱冻存备用血清，按说明书操作，根据各OD 值，使用计算机软件，绘制出标准曲线，计算样品含量。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.0 统计软件进行分析。计量资料若为正态分布且方差齐性，进行t 检验或方差分析，否则进行Kruskal-Wallis 秩和检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 症状 造模5 d 后，模型组小鼠广泛肛门部位有血迹，干预组小鼠部分肛门部位有血迹，正常组无明显异常。10 d 后除模型组小鼠外，其余小鼠肛门部位血迹逐渐消失。

2.2 体质量 对照组、模型组、干预组小鼠平均体质量分别为(26.90 ±0.99)g、(24.80 ±1.62)g、(25.50±1.08)g。各组体质量相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 肠黏膜炎症程度 根据各组病理评分进行统计，正常组、模型组、干预组秩均值分别为3. 92、22.67、10.67，模型组炎症最重，干预组因剂量炎症明显减轻，差异有统计学意义(P ＜0.01，见图1)。

图1 各组小鼠肠黏膜病理图 A:对照组;B:模型组;C:干预组.Fig 1 Intestinal mucosal pathological picture of each group A:control group;B:model group;C:interventional group

2.4 小鼠血清脂联素、趋化素、瘦素水平 模型组趋化素、瘦素均较对照组高(P ＜0.05)，但脂联素较对照组低(P ＜0. 05)。干预组瘦素低于模型组(P ＜0.05)，但趋化素、脂联素与模型组比较，差异无统计学意义(P ＞0.05，见表1)。

表1 各组小鼠血清脂联素、趋化素、瘦素水平(ng/ml)Tab 1 Serum chemerin，leptin，adiponectin of each group(ng/ml)

3 讨论

脂肪组织不仅是能量储存的器官，它还具有调节内分泌、能量代谢及炎症反应的功能。脂肪组织可以分泌多种细胞因子，与代谢性疾病、心脑血管疾病、骨关节及内脏炎症有关，通称为脂肪细胞因子。其中一些可能联系着IBD 的发生发展，又以针对脂联素、趋化素、瘦素的研究居多。趋化素又称他扎罗汀诱导基因2 或视黄酸受体反应蛋白2。作为趋化素R 的天然配体，具有多种生物学效应。然而，其确切生理作用目前尚不清楚。趋化素可由脂肪组织释放，参与机体的免疫应答过程，募集表达有cMKLRl 的单核细胞源性巨噬细胞和DC 细胞通过自分泌或旁分泌途径作用于受体CMKLRl，通过趋化素/CMKLR1 相互作用实现对局部炎性反应的免疫反应［1-2］。研究发现IBD 患者血清趋化素升高，尤其在CD 患者中更为明显，认为其可能与IBD 发病有关［3-4］。本研究中也观察到了模型组趋化素较高的情况。

瘦素主要由白色脂肪组织产生，其他组织也可产生，受体亦广泛分布于各组织中。瘦素可以刺激单核细胞分泌TNF-α、IL-6 等细胞因子并合成一氧化氮;活化T 细胞、激活肠道上皮NF-κβ 途径［5］，发生炎症部位的肠上皮细胞还可直接向肠腔释放瘦素进一步直接损伤局部肠道上皮。还能促使多形核细胞表达CD11b，同时释放活性氧［6］。在严重的UC 患者中发现血清瘦素的升高［7］。本研究也观察到了类似的现象。而最新的文献提出瘦素的拮抗剂PG-MLA 在动物实验中可减轻肠道炎症水平，减少炎症因子生成，对结肠炎有治疗作用［8-9］。这些都说明瘦素可能在IBD 的发生、发展中起促炎症反应的作用。

脂联素也是由白色脂肪组织产生和表达的一种内源性生物活性多肽或蛋白，最初认为与糖代谢、脂代谢及胰岛素敏感性有关。后发现其可通过抑制巨噬细胞前体细胞的生长、抑制成熟巨噬细胞的功能等多种途径参与、调节炎症反应，与类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、IBD 等自身免疫疾病有关［10-11］。Yamamoto等［10］研究显示，CD 患者炎性肠段附近肠系膜脂肪组织中脂联素mRNA 和蛋白水平的表达高于对照组。同时其正常的肠系膜脂肪组织释放的脂联素要多于对照组或UC 患者。该研究还发现同一患者体内，有炎症的肠段脂肪组织中脂联素含量也高于无炎症肠段。Valentini 等［12］却在IBD 患者中观察到脂联素水平的下降，本实验中脂联素也较正常对照降低。脂联素在IBD 致病中所起的作用还存在学术争议。

以丹参乙酸镁(丹酚酸B 镁盐)为主要成分的丹参多酚酸盐注射液是中国第一个拥有人体药代动力学参数的中医药制剂，是迄今各种丹参制剂中含有效成分最明确、含量高的一个品种，具有抗炎、抗血小板聚集、清除自由基等多种作用。不少临床研究显示丹参制剂可调节脂肪因子，但目前没有应用于IBD 治疗的报道。我们之前的工作已发现丹参多酚酸盐在一定的剂量下可通过下调血清IL-6、CD40L/CD40 系统起到治疗结肠炎的作用［13-14］。而本实验发现丹参多酚酸盐除了减轻肠道炎症程度之外，还可使血清瘦素水平降低，但对趋化素及ADPN 无明显影响。丹参多酚酸盐能调节部分血清脂肪因子，也许是其直接调控CD40L/CD40 炎症通路外另一方面的作用机制。

本实验观察到模型组的血清趋化素、趋化素、瘦素升高，脂联素降低，也有不少文献得到截然相反的结论。这可能是由于脂肪因子同时具有抑炎和促炎的作用，在炎症的不同阶段可能扮演着不同的角色。当然，人类和动物的机体也存在许多差异，因此，脂肪因子的意义需要基础结合临床更细致全面的研究。总之，脂肪因子在IBD 中所起的作用非常复杂，需要更长时间、更深入系统地针对急慢性炎症不同的情况进行研究。

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