瑞巴派特对阿司匹林损伤大鼠小肠黏膜通透性的保护作用

杨 成， 崔梅花， 梁 君， 李 静

北京大学航天临床医学院消化科，北京 100049

瑞巴派特对阿司匹林损伤大鼠小肠黏膜通透性的保护作用

杨 成， 崔梅花， 梁 君， 李 静

北京大学航天临床医学院消化科，北京 100049

目的探讨瑞巴派特对阿司匹林致大鼠小肠黏膜损伤的保护作用及其可能的机制。方法将30只Wistar大鼠随机平均分为空白对照组、阿司匹林损伤组和低、中、高剂量瑞巴派特保护组。采用阿司匹林150 mg·kg-1·d-1灌胃，连续14 d，瑞巴派特组在每次造模前30 min给予保护。观察小肠黏膜组织病理和超微结构改变，检测黏膜髓过氧化物酶(MPO)、黏蛋白2(MUC2)水平，采用免疫组织化学方法检测紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达，检测血清D-乳酸水平。结果阿司匹林组小肠黏膜损伤，黏膜MPO、血清D-乳酸增加(P<0.05)，MUC2、ZO-1和Occludin表达量减少(P<0.05)，瑞巴派特可不同程度缓解以上改变。结论瑞巴派特对阿司匹林损伤小肠黏膜通透性具有保护作用，其机制可能包括减轻炎症、增加MUC2的分泌、保护细胞紧密连接蛋白ZO-1和Occludin。

瑞巴派特；阿司匹林；紧密连接蛋白；肠黏膜通透性

以阿司匹林和吲哚美辛等为代表的非甾体类抗炎药(NSAIDs)广泛应用于临床，由其导致的NSAIDs相关胃肠疾病也备受关注。以往临床主要关注胃黏膜损伤，随着小肠疾病诊断技术的发展，越来越多报道证实，小肠损伤也很普遍[1]。而临床早期常常没有明显的症状，主要表现为亚临床肠病，因此也容易被忽略，部分发展为严重并发症才被发现[2]。NSAIDs致胃黏膜损伤和小肠黏膜损伤的具体机制也不一致[3]。临床上使用质子泵抑制剂(PPI)和H2受体拮抗剂治疗通常对胃黏膜损伤有很好的保护作用，但对小肠黏膜损伤的保护作用存在一定争议[4-5]。本实验旨在研究瑞巴派特对阿司匹林致大鼠小肠黏膜损伤的保护作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1 试剂和药物：阿司匹林(德国拜耳医疗)；瑞巴派特(浙江远力健药业有限责任公司)；MPO和MUC2 ELISA测试盒(Cloud-Clone Corp公司)；ZO-1和Occludin一抗(Introvigen公司)；D-乳酸试剂盒(美国Biovision公司)。

1.1.2 实验动物：雌性Wistar大鼠(体质量180～200 g)30只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于北京大学人民医院SPF级实验动物中心，室温20～25 ℃，湿度约55%，12 h昼夜循环。

1.2实验方法

1.2.1 动物分组及干预：30只大鼠随机分为空白对照组、阿司匹林组(ASA组)、低剂量瑞巴派特组(LRG组)、中剂量瑞巴派特组(MRG组)、高剂量瑞巴派特组(HRG组)，每组6只，分笼饲养。阿司匹林粉末以质量浓度为5 g/L的羧甲基纤维素钠溶液制成悬浮液，瑞巴派特溶于生理盐水。LRG、MRG、HRG组大鼠分别予瑞巴派特剂量为30 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg溶液1 ml灌胃，空白对照组和ASA组予等剂量生理盐水灌胃。30 min后，LRG、MRG、HRG组和ASA组大鼠予阿司匹林剂量为150 mg/kg悬浮液1 ml灌胃，空白对照组予同样剂量羧甲基纤维素钠溶液灌胃。以上灌胃流程持续重复14 d，于第15天在质量浓度为20 g/L的异氟烷麻醉机(型号：MSS-3)麻醉下取材，沿腹中线剪开，距回盲部5 cm处分别取1 cm回肠用于HE、PAS、IHC染色。

1.2.2 小肠黏膜HE染色和病理损伤评分：将小肠组织用质量浓度为40 g/L的中性甲醛固定24 h，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察小肠组织的病理学变化，参照Chiu肠黏膜损伤评分法进行病理损伤评分[6]。

1.2.3 小肠黏膜PAS染色：常规质量浓度为40 g/L的中性甲醛固定，脱水包埋，切片，蒸馏水浸洗，过碘酸溶液染色，冲洗，样本置于Schiff Reagent染色，冲洗，苏木素复染。光镜下观察。

1.2.4 紧密连接蛋白ZO-1和Occludin免疫组织化学染色：石蜡切片脱蜡，抗原修复，封闭，加ZO-1抗体(1∶150)或Occludin抗体(1∶150)4 ℃过夜，PBS冲洗，加二抗，PBS冲洗，DAB显色，镜下控制显色时间，苏木精复染、脱水、透明、树胶封片。结果进行综合评分[7]。

1.2.5 黏膜MPO和MUC2含量检测：取适量小肠组织，于预冷PBS中清洗去除血液，称重后备用。将组织块移入玻璃匀浆器，加入5～10 ml预冷PBS在冰上进行充分研磨。得到的匀浆液反复冻融2次。将制备好的匀浆液于5 000×g离心5 min，留取上清，分别按照MPO和MUC2试剂盒进行检测，用酶标仪(型号：iMark)在450 nm波长下测定吸光度值，按标准曲线计算样品浓度。

1.2.6 小肠黏膜透射电镜检测：距回盲部5 cm处切取面积约1 mm3的回肠，置于质量浓度为30 g/L的戊二醛溶液，清洗，质量浓度为10 g/L的锇酸固定，脱水，包埋，聚合，超薄切片，柠檬酸铅染色，水洗干燥后透射电镜(型号：FEI TECNAI SPIRIT)观察，照相。

1.2.7 血清D-乳酸含量：将大鼠置于质量浓度为20 g/L的异氟烷维持麻醉下，沿腹中线剪开，采取下腔静脉血3 ml于EDTA抗凝管中，2 000 r/min离心20 min，取上清液于EP管中，-80 ℃冰箱冻存备用。具体步骤按照D-乳酸试剂盒说明书进行，在450 nm波长下测定分光光度值，按标准曲线计算样品浓度。

2 结果

2.1瑞巴派特对阿司匹林引起小肠损伤的影响空白对照组：小肠黏膜上皮结构完整，形态正常，未见糜烂和溃疡；ASA组：小肠部分绒毛脱落，可见坏死、糜烂及溃疡形成，固有层炎细胞浸润；给予瑞巴派特保护后，损伤程度较ASA组有不同程度的减轻。使用Chiu评分系统，我们半定量评估了大鼠的损伤程度，ASA组为(4.2±0.54)明显高于空白对照组(0.78±0.39)(P<0.05)。MRG组为(2.2±0.54)和HRG组(1.99±0.54)明显低于ASA组(P<0.05)，LRG组(3.52±0.54)略低于ASA组，差异无统计学意义(P>0.05)。ASA组相比空白对照组，炎性指标MPO的表达量明显增加(13.18±3.44)ng/mg(P<0.05)。不同剂量的瑞巴派特组，MPO的表达均明显降低(P<0.05，见图1)。

2.2瑞巴派特对小肠黏膜MUC2含量的影响ASA组使小肠黏膜MUC2蛋白含量(0.81±0.70)明显减少(P<0.05)，而HRG组能够显著增加MUC2含量(2.34±0.92)(P<0.05)，而LRG组和MRG组没有明显的增加(P>0.05)。另外，通过过碘酸-雪夫染色可见分泌MUC2的杯状细胞，ASA组的杯状细胞数量明显下降，排列紊乱。而给予不同剂量的瑞巴派特保护后，杯状细胞数量逐渐增多，排列逐步恢复正常(见图2)。

2.3紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的变化各组免疫组织化学染色结果显示，空白对照组紧密连接蛋白ZO-1和Occludin完整地分布于小肠黏膜上皮细胞膜，均表达为棕褐色强信号。ASA损伤组肠黏膜ZO-1蛋白染色评分(2.50±0.548)较空白对照组(6.33±0.516)明显减少(P<0.05)。LRG组、MRG组和HRG组的ZO-1蛋白染色评分分别为3.50±0.548、4.50±0.837、5.83±0.983，较ASA组明显增加(P<0.05)。ASA损伤组肠黏膜Occludin蛋白染色评分(2.00±1.095)较空白对照组(6.83±0.408)减少(P<0.05)。MRG组(4.17±0.983)和HRG组(6.50±0.548)的Occludin蛋白染色评分，较ASA组明显增加(P<0.05)，而LRG组(2.33±0.516)与ASA组间比较,差异无统计学意义(P>0.05，见图3)。

注：1：空白对照组；2：ASA组；3：LRG组；4：MRG组；5：HRG组。与1比较，aP<0.05；与2比较，bP<0.05。

注：1：空白对照组；2:ASA组；3：LRG组；4：MRG组；5：HRG组。与1比较，aP<0.05；与2比较，bP<0.05。图2 小肠黏膜MUC2表达和PAS染色(100×) A：各组小肠MUC2蛋白的表达量；B：空白对照组；C：ASA组；D：LRG组；E：MRG组；F：HRG组Fig 2 Expression of MUC2 in small intestines and the PAS stain (100×) A: the expression of MUC2 protein in each group; B: control group; C: ASA group; D: LRG group; E: MRG group; F: HRG group

2.4小肠黏膜上皮超微结构的改变空白对照组小肠黏膜上皮微绒毛排列整齐，上皮细胞间的紧密连接正常。给予阿司匹林后小肠黏膜的微绒毛变短、减少，排列紊乱、稀疏，细胞紧密连接间隙增宽。MRG组和HRG组微绒毛和细胞紧密连接间隙得到很大改善，接近空白对照组，而LRG组改善不明显(见图4)。

2.5肠道通透性的变化检测血清中D-乳酸反映肠道通透性改变，在空白对照组中，血清D-乳酸的浓度为(1.58±0.48)mmol/L，而ASA组为(4.61±1.71)mmol/L，肠道黏膜受损，通透性较空白对照组明显升高(P<0.05)。MRG组(3.50±0.90)mmol/L和HRG组(3.08±0.87)mmol/L,D-乳酸水平较ASA组明显下降(P<0.05)，LRG组(2.12±0.83)mmol/L较ASA组无明显减少(P>0.05,见图5)。

3 讨论

目前认为，阿司匹林等NSAIDs类药致小肠黏膜损伤的机制主要包括：一方面，阿司匹林等NSAIDs抑制环氧合酶(COX)尤其是COX-1的活性，减少了内源性前列腺素的合成与释放，破坏肠上皮黏膜的屏障作用[8]。另一方面，NSAIDs通过肠道、血流和胆道集聚在小肠，对小肠黏膜细胞造成刺激作用[9]。若持续接触药物，肠黏膜上皮细胞的通透性将会增加。正常肠道中有许多的肠道菌群，细菌分泌的内毒素将会渗透黏膜细胞到达肠道黏膜固有层，激活机体的免疫系统，使炎症细胞聚集到肠黏膜损伤部位。长期使用NSAIDs通过以上可能的机制逐渐导致小肠黏膜溃疡、出血、狭窄甚至穿孔。阿司匹林与其他NSAIDs致病机制不完全一致，没有肝肠循环，其损伤程度也较小。肠黏膜通透性的增加是阿司匹林致小肠黏膜损伤的早期改变，也是其引起肠病的起始环节。

图3 ZO-1和Occludin蛋白的免疫组织化学染色(400×) A：空白对照组；B：ASA组；C：LRC组；D：MRC组；E：HRC组

注：黑色箭头标记微绒毛，白色箭头标记上皮细胞间的紧密连接。

注：与Control组比较，aP<0.05；与ASA组比较，bP<0.05。

瑞巴派特作为黏膜保护剂由于其同时具有增加内源性前列腺素、促进黏液的分泌、清除黏膜上皮细胞氧自由基、促进黏膜再生等作用，使其在防治阿司匹林等NSAIDs导致的肠病中被逐渐重视[10]。虽然瑞巴派特在临床上广泛应用，但其对黏膜屏障影响的机制尚未阐明。肠黏膜MPO水平能代表其炎症程度，本研究中MPO的改变与病理结果基本一致，均表明瑞巴派特能显著减轻阿司匹林导致小肠黏膜损伤后的炎症程度。

由肠黏液层、上皮细胞及其间的细胞连接复合体组成的机械屏障是抵御各种毒素、有害物质及致病菌入侵机体的第一道且是最重要的屏障，对维持肠道正常功能起重要作用[11]。MUC2主要由杯状细胞分泌，是构成肠黏液层的主要物质，是一种高度糖基化的大分子量黏蛋白，覆盖于肠上皮细胞顶端，在润滑肠道、为肠内抗菌蛋白及共生菌群提供黏附位点、抵御肠内致病菌及有害物质入侵等方面发挥着重要功能[12]。现已有多种研究证实，使用阿司匹林等NSAIDs可导致黏液层变薄，使得肠内细菌和毒素更加容易接触肠上皮细胞，随着屏障功能进一步破坏，侵袭力也成瀑布式增加，造成恶性循环[13-15]。本实验结合对杯状细胞特异性的PAS染色和MUC2定量研究表明，不同浓度的瑞巴派特能保护被阿司匹林破坏的杯状细胞，使MUC2的表达量显著增加，恢复一定程度肠道黏液层的完整性。

肠上皮细胞间的有多种连接，其中以紧密连接最为重要，它能封闭细胞间隙，防止肠腔有害物质自由穿过上皮层，对调节肠道黏膜通透性起重要作用[16]。紧密连接以ZO-1和Occludin蛋白最为重要，Occludin与ZO-1相互作用后能调节细胞内外信号传导途径，改变肌动蛋白收缩性，影响细胞间紧密连接的装配与功能，调节其通透性[17]。在本研究中，应用阿司匹林造模后，大鼠小肠组织中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达量均明显下降，导致连接复合体破坏，肠黏膜通透性增加。而不同剂量的瑞巴派特保护组中ZO-1和Occludin表达量较损伤组明显上调。同时，通过透射电镜也可以看出瑞巴派特保护组中小肠黏膜上皮细胞间的缝隙也较损伤组减小，说明瑞巴派特对阿司匹林致小肠黏膜损伤的保护机制与上调紧密连接蛋白ZO-1和Occludin有关，这与Lai等[18]的结果一致。

另外，本研究中选用D-乳酸水平进一步证实了瑞巴派特对肠道黏膜通透性的改变作用。大鼠体内D-乳酸是肠道内细菌的代谢产物，而其他组织不产生D-乳酸，故血清中的D-乳酸可以认为是来源于肠道。由于大鼠体内缺乏代谢D-乳酸的D-乳酸脱氢酶，当给予阿司匹林后，肠道黏膜屏障受损，肠道通透性增加，D-乳酸就能通过受损的黏膜进入血液，所以，血液中D-乳酸的水平可以作为肠黏膜屏障损伤和其通透性改变的良好指标[19]。本研究中ASA组中小肠黏膜通透性最高，而不同浓度瑞巴派特组黏膜通透性随药物浓度升高而逐渐降低，作用呈浓度依赖性，与瑞巴派特对ZO-1和Occludin的影响相一致，进一步说明紧密连接与细胞通透性的密切关系。

综上所述，瑞巴派特对阿司匹林诱导小肠黏膜损伤有较好的保护作用，其机制可能包括：在阿司匹林损伤小肠黏膜早期减轻炎症反应、增加黏蛋白MUC2的分泌、保护细胞紧密连接蛋白ZO-1和Occludin，在一定程度上降低了阿司匹林诱导的小肠黏膜通透性的增加，保障了小肠黏膜屏障的完整性，从而防止小肠黏膜进一步的损伤。

[1] Fujimori S, Sakamoto C. Actual status and vision of NSAIDs-induced intestinal injuries [J]. Nihon Rinsho, 2011, 69(6): 1075-1082.

[2] Park SC, Chun HJ, Kang CD, et al. Prevention and management of non-steroidal anti-inflammatory drugs-induced small intestinal injury [J]. World J Gastroenterol, 2011, 17(42): 4647-4653.

[3] Takeuchi K, Satoh H. NSAID-induced small intestinal damage--roles of various pathogenic factors [J]. Digestion, 2015, 91(3): 218-232.

[4] Wallace JL, Syer S, Denou E, et al. Proton pump inhibitors exacerbate NSAID-induced small intestinal injury by inducing dysbiosis [J]. Gastroenterology, 2011, 141(4): 1314-1322, e1-e5.

[5] Edogawa S, Takeuchi T, Kojima Y, et al. Current topics of strategy of NSAID-induced small intestinal lesions [J]. Digestion, 2015, 92(2): 99-107.

[6] Chiu CJ, McArdle AH, Brown R, et al. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal [J]. Arch Surg, 1970, 101(4): 478-483.

[7] 许良中, 杨文涛. 免疫组织化学反应结果的判断标准[J]. 中国癌症杂志, 1996, 6(4): 229-231.

[8] Wallace JL. NSAID gastropathy and enteropathy: distinct pathogenesis likely necessitates distinct prevention strategies [J]. Br J Pharmacol, 2012, 165(1): 67-74.

[9] Mayo SA, Song YK, Cruz MR, et al. Indomethacin injury to the rat small intestine is dependent upon biliary secretion and is associated with overgrowth of enterococci [J]. Physiol Rep, 2016, 4(6). pii: e12725.

[10] Kurokawa S, Katsuki S, Fujita T, et al. A randomized, double-blinded, placebo-controlled, multicenter trial, healing effect of rebamipide in patients with low-dose aspirin and/or non-steroidal anti-inflammatory drug induced small bowel injury [J]. J Gastroenterol, 2014, 49(2): 239-244.

[11] Scaldaferri F, Pizzoferrato M, Gerardi V, et al. The gut barrier: new acquisitions and therapeutic approaches [J]. J Clin Gastroenterol, 2012, 46 Suppl: S12-S17.

[12] Johansson ME, Ambort D, Pelaseyed T, et al. Composition and functional role of the mucus layers in the intestine [J]. Cell Mol Life Sci, 2011, 68(22): 3635-3641.

[13] Iwai T, Ichikawa T, Kida M, et al. Vulnerable sites and changes in mucin in the rat small intestine after non-steroidal anti-inflammatory drugs administration [J]. Dig Dis Sci, 2010, 55(12): 3369-3376.

[14] Satoh H, Amagase K, Takeuchi K. Mucosal protective agents prevent exacerbation of NSAID-induced small intestinal lesions caused by antisecretory drugs in rats [J]. J Pharmacol Exp Ther, 2014, 348(2): 227-235.

[15] Choudry HA, Mavanur A, O'Malley ME, et al. Chronic anti-inflammatory drug therapy inhibits gel-forming mucin production in a murine xenograft model of human pseudomyxoma peritonei [J]. Ann Surg Oncol, 2012, 19(5): 1402-1409.

[16] Shen L, Weber CR, Raleigh DR, et al. Tight junction pore and leak pathways: a dynamic duo [J]. Annu Rev Physiol, 2011, 73: 283-309.

[17] Zhang S, Zheng S, Wang X, et al. Carbon monoxide-releasing molecule-2 reduces intestinal epithelial tight-junction damage and mortality in septic rats [J]. PLoS One, 2015, 10(12): e145988.

[18] Lai Y, Zhong W, Yu T, et al. Rebamipide promotes the regeneration of aspirin-induced small-intestine mucosal injury through accumulation of β-Catenin [J]. PLoS One, 2015, 10(7): e0132031.

[19] Sun YJ, Cao HJ, Jin Q, et al. Effects of penehyclidine hydrochloride on rat intestinal barrier function during cardiopulmonary bypass [J]. World J Gastroenterol, 2011, 17(16): 2137-2142.

(责任编辑：马 军)

ProtectiveeffectofRebamipideonthesmallintestinalpermeabilityinratswithAspirin-induced

YANG Cheng, CUI Meihua, LIANG Jun, LI Jing

Department of Gastroenterology, Peking University Aerospace School of Clinical Medicine, Beijing 100049, China

ObjectiveTo investigate the protective effect of Rebamipide on small intestinal permeability Aspirin-induced in rats and its possible mechanism.MethodsThirty Wistar rats were randomly and equally divided into control group, Aspirin-injuried group and low-dose, middle-dose, high-dose Rebamipide treated group. Rats were administered Aspirin (150·kg-1·d-1, p.o.) for 14 days except for control group. Rebamipide was given 30 min before the administration of Aspirin except for Aspirin in injuried group and control group. Small intestinal tissues were observed for histopathoclogic and ultrastructural pathology changes and expressions of MPO and MUC2 were determined by ELISA. Immunohistochemistry was used to detect the distribution and expressions of intestinal epithelial tight junction protein ZO-1 and Occludin. The expression of D-lactate was examined.ResultsAspirin produced lesions in small intestine, accompanied with the increase of MPO and D-lactate (P<0.05), with decrease of MUC2, ZO-1 and Occludin (P<0.05). Rebamipide could protect these changes to some extent.ConclusionRebamipide protects against Aspirin-induced changes of the small intestinal permeability, probably by alleviating inflammation, increasing MUC2 and protecting tight junction protein.

Rebamipide; Aspirin; Tight junction protein; Intestinal permeability

航天中心医院特色临床医学发展科研项目(YN201604)

杨成，在读硕士，E-mail： pkuyc66@163.com

崔梅花，主任医师，副教授，研究方向：幽门螺杆菌、胃癌发病机制及炎症性肠病。E-mail： cuimeih@sina.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.11.016

R574.5

A

1006-5709(2017)11-1258-05

2017-01-10