瘦素在猪螺杆菌感染后胃黏膜相关淋巴样组织形成中的作用

刘亚倩，张翠萍，田字彬，杨 林，于亚男，杨若明，李晓宇，赵文君，任琳琳，张帅庆

1.青岛大学附属医院消化内科，山东 青岛 266003； 2.山东大学齐鲁医院消化内科

瘦素在猪螺杆菌感染后胃黏膜相关淋巴样组织形成中的作用

刘亚倩1，张翠萍1，田字彬1，杨 林1，于亚男1，杨若明1，李晓宇1，赵文君1，任琳琳1，张帅庆2

1.青岛大学附属医院消化内科，山东 青岛 266003； 2.山东大学齐鲁医院消化内科

目的研究瘦素在猪螺杆菌(Helicobacter suis,H.suis)感染后胃黏膜相关淋巴样组织(mucosa-associated lymphoid tissue,MALT)形成中的作用及其可能的机制。方法C57BL/6野生型小鼠、瘦素缺陷(Ob/Ob)小鼠各20只随机分为以下四组：正常小鼠未感染组(WT组)、正常小鼠H.suis感染组(WT+HS组)、Ob/Ob小鼠未感染组(Ob组)、Ob/Ob小鼠H.suis感染组(Ob+HS组)，每组10只，感染12周后处死，收集小鼠血清与胃组织。采用HE染色检测各组小鼠胃黏膜淋巴滤泡的数量与大小；酶联免疫吸附测定(ELISA)检测各组小鼠血清中瘦素的浓度；实时荧光定量PCR检测各组小鼠胃黏膜中瘦素及其受体Ob-R、炎症因子IFN-γ及趋化因子CXCL13 mRNA表达水平。结果正常小鼠感染H.suis后可见胃黏膜淋巴滤泡形成；与WT+HS组相比，Ob+HS组小鼠血清及胃黏膜中均未检测到瘦素的表达，胃黏膜中未观察到淋巴滤泡形成，且IFN-γ与CXCL13 mRNA表达水平明显降低；体外实验结果发现，瘦素可刺激淋巴瘤B细胞分泌表达IFN-γ。结论瘦素可能通过促进H.suis感染后胃黏膜IFN-γ的表达参与了胃MALT的形成。

瘦素；猪螺杆菌；干扰素γ；胃黏膜相关淋巴组织

猪螺杆菌(Helicobacter suis，H.suis)即海尔曼螺杆菌(Helicobacter heilmannii)1 型，是已知的人胃内不同于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)的另一种革兰氏阴性杆菌，能自然定植于包括人在内的诸多动物胃内，其感染率明显低于H.pylori，多通过胃镜检出[1]，主要与慢性胃炎[2]、胃黏膜相关淋巴样组织(mucosa-associated lymphoid tissue,MALT)淋巴瘤的发生密切相关[3]。H.suis感染胃黏膜后可引起淋巴细胞浸润，激活上皮细胞和固有免疫细胞，诱导炎症因子的产生，形成获得性MALT。在此免疫学背景下，慢性炎症的长期刺激可导致淋巴细胞的克隆生长，形成以B细胞为主的MALT淋巴瘤。因此，深入研究螺杆菌感染后MALT形成的机制并进行相应的干预，对预防胃MALT淋巴瘤的发生具有重要意义。

随着社会经济的发展和饮食结构的变化，全世界肥胖人群的比例逐年上升，已经成为威胁公众健康的重要问题之一。目前许多流行病学资料显示，肥胖是许多肿瘤(包括胃MALT淋巴瘤)发病的重要危险因素，并能增加其死亡率[4-6]。我们前期研究发现，高脂饮食诱导的肥胖可明显促进H.suis感染后胃MALT的形成，同时伴有瘦素表达水平的升高，说明肥胖与MALT淋巴瘤的发生密切相关，其机制可能与瘦素的高表达有关[7]。瘦素作为一种由肥胖基因(obese,Ob)编码的多肽类激素，主要在脂肪组织中表达，具有广泛的生物学效应[8]。脂肪组织分泌的瘦素也存在于正常胃黏膜组织中，目前被视为驱动胃肠道肿瘤发生、发展的一种新的生长因子，与其受体Ob-R结合后可通过激活信号传导与转录活化因子(signal transducers and activators transcription，STAT)3等通路参与肿瘤的发生[9-10]。既往研究[11]发现，B细胞分泌的干扰素(Interferon-γ, IFN)及滤泡树突状细胞(follicular dendritic cells, FDC)分泌的CXCL13是H.suis感染后胃MALT形成的关键因子，IFN-γ可能通过促进CXCL13的分泌参与了H.suis感染后胃MALT的形成[12]。另一方面，瘦素还可通过诱导多种炎症因子和趋化因子的上调来间接发挥促癌效应[13]。例如，瘦素可作用于CD4+T细胞，使其分泌IFN-γ增加，增强了Th1反应[14-15]。因此，我们推测瘦素可能通过促进H.suis感染后胃黏膜IFN-γ的表达参与了胃MALT的形成。本研究通过构建H.suis感染的正常小鼠与瘦素缺陷小鼠(Ob/Ob小鼠)模型，探讨瘦素在H.suis感染后胃MALT形成中的作用及其可能的机制，有望为螺杆菌感染后胃MALT的形成提供理论基础，以指导螺杆菌感染相关性胃疾病的防治。

1 材料与方法

1.1实验动物8周龄雌性SPF级C57BL/6野生型小鼠与瘦素缺陷小鼠(Ob/Ob小鼠)各20只，分别购自济南朋悦实验动物繁育有限公司与常州卡文斯实验动物有限公司，体质量18～20 g，饲养于青岛大学附属医院动物实验室(SPF级)，温度20～26 ℃，湿度40%～70%，照明12 h/d。水、鼠粮、垫料均经高温高压灭菌，笼具定期消毒。

1.2小鼠感染模型的建立C57BL/6野生型小鼠20只随机分为正常小鼠未感染组(WT组)与正常小鼠H.suis感染组(WT+HS组)；瘦素缺陷小鼠(Ob/Ob小鼠)20只随机分为Ob/Ob小鼠未感染组(Ob组)与Ob/Ob小鼠H.suis感染组(Ob+HS组)，每组10只。取5只已感染H.suis的供体小鼠胃组织，加入无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)后刮取胃黏膜匀浆定容，将匀浆液等量灌胃于WT+HS组与Ob+HS组小鼠(每只小鼠0.2 ml)建立H.suis感染模型，根据文献[16]方法行PCR检测证实其胃内只有H.suis定植而没有H.pylori等其他螺杆菌的感染。WT组和Ob组小鼠分别给予等体积的来自正常小鼠的胃黏膜匀浆液灌胃。造模期间所有小鼠均自由摄食、饮水。

1.3小鼠血清与胃组织的收集感染12周后，各组小鼠腹腔注射质量浓度为100 g/L水合氯醛(400 mg/kg)进行麻醉，心脏取血 1 ml，4 ℃下12 000×g离心 10 min后分离血清；小鼠脱颈处死后取其胃组织，沿大弯剪开，以无菌PBS冲洗胃内容物；一半胃组织石蜡包埋行苏木精-伊红(HE)染色，另一半胃组织用于提取RNA。

1.4细胞培养与体外刺激实验人B细胞淋巴瘤细胞株(Toledo)购自 ATCC (American Type Culture Collection)，培养于每孔含有2 ml RPMI-1640营养液(购自Sigma-Aldrich，加入青、链霉素与质量浓度为100 g/L的胎牛血清)的6孔细胞培养板中，共分为A-H共8个板，每孔细胞数为1×106。B板与D板加入重组的人瘦素(购自R&D Systems)使其终浓度为10 ng/ml后分别刺激24 h、48 h；F板与H板加入人瘦素使其终浓度为100 ng/ml后也分别刺激24 h、48 h；A板、C板加入与B板、D板等体积的双蒸水后分别培养24 h、48 h；E板、G板加入与F板、H板等体积的双蒸水后分别培养24 h、48 h作为对照。收集各孔培养体系离心后分别获得细胞和上清液。

1.5相关指标检测小鼠胃组织经石蜡包埋后10 μm连续切片，行HE染色后检测单位长度胃黏膜中淋巴滤泡的数量及大小。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测各组小鼠血清瘦素的浓度及体外实验各组上清液中IFN-γ的浓度，具体操作按试剂盒(均购自Neo Scientific)说明进行。采用Trizol法 (购自TaKaRa公司)提取胃组织总RNA，测定RNA的纯度和浓度后取1 μg RNA进行逆转录反应得到cDNA，用SYBR Green试剂盒 (TaKaRa) 进行实时荧光定量PCR，利用ΔΔCt法确定各样本胃黏膜中H.suis16S rRNA及其受体Ob-R、IFN-γ、CXCL13及体外实验各组细胞中IFN-γ mRNA相对表达水平。实验所用的引物序列如表1所示。

表1 引物序列表

2 结果

2.1各组小鼠胃内菌量与MALT形成情况小鼠感染H.suis12周后，WT+HS组与Ob+HS组小鼠胃黏膜中均检测到H.suis16S rRNA的表达，两组相对菌量比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。WT+HS组小鼠胃黏膜中可见明显淋巴滤泡形成，而Ob+HS组小鼠胃黏膜中未检测到淋巴滤泡形成(见图1、表2)，说明瘦素是H.suis感染后胃MALT形成所必需的因子，且其对胃内菌量水平无显著影响。

2.2各组小鼠血清瘦素浓度及胃组织中瘦素、Ob-R、IFN-γ及CXCL13mRNA表达水平感染H.suis12周后， WT+HS组小鼠血清瘦素的浓度及胃黏膜中瘦素mRNA的表达水平均较WT组明显增加；Ob组与Ob+HS组小鼠血清及胃黏膜中均未检测到瘦素的表达。同时，WT+HS组小鼠胃黏膜中瘦素、受体Ob-R、炎症因子IFN-γ与趋化因子CXCL13的mRNA表达水平也较WT组明显增加；而上述因子在Ob组与Ob+HS组小鼠胃黏膜中的表达水平无显著性差异，均明显低于WT+HS组(见表3)，说明瘦素可能是H.suis感染后胃黏膜IFN-γ与CXCL13上调的重要因子。

表2 小鼠感染H.suis后胃内菌量与淋巴滤泡的形成

图1 各组小鼠感染H.suis后胃黏膜淋巴滤泡的形成情况(HE 40×) Fig 1 The formation of lymphoid follicles in the stomach of mice after H.suis infection (HE 40×)

表3 各组小鼠血清瘦素浓度与胃组织中瘦素及其受体Ob-R、IFN-γ、CXCL13 mRNA表达水平Tab 3 The expressions of leptin in serum and the expressions of leptin and its receptor Ob-R，IFN-γ，CXCL13 mRNA in the stomach of mice (±s)

注：与WT组相比，*P<0.01；与Ob组相比，&P>0.05；与WT+HS组相比，#P<0.01。

2.3不同瘦素刺激浓度及刺激时间对淋巴瘤B细胞分泌表达IFN-γ的影响人B细胞淋巴瘤细胞株在体外经不同浓度的瘦素分别刺激不同时间后发现，瘦素处理组培养液中IFN-γ的浓度及细胞中IFN-γ mRNA的表达水平分别较各自对照组显著增加；随着刺激浓度或刺激时间的增加，培养液中IFN-γ的浓度与细胞中IFN-γ的表达水平也相应增加，差异有统计学意义(见表4)，说明瘦素在体外可刺激B细胞分泌IFN-γ。

表4 不同瘦素刺激浓度及刺激时间对淋巴瘤B细胞分泌表达IFN-γ的影响Tab 4 The effect of leptin under different concentrations and different time length on IFN-γ secretion and expression in the lymphoma B cells (±s)

注：与各自对照组相比，*P<0.01； 与10 ng/ml-24 h处理组相比，&P<0.01；与100 ng/ml-24 h处理组相比，#P<0.01。

3 讨论

H.suis是人胃内除H.pylori之外最常见的螺杆菌，虽然感染率较低，但能自然定植于人和诸多动物胃内并具有致病性。由于H.pylori长期感染小动物模型的构建一直有其局限性，如H.pylori较难长期稳定定植于小鼠胃内，诱导胃黏膜癌变或胃MALT淋巴瘤的形成耗时较长、成功率较低等，极大地阻碍了其致病机理、治疗效果和疫苗的研究工作。国外有文献[17]报道，小鼠感染H.suis6个月后胃中几乎100%出现MALT淋巴瘤特征性的淋巴上皮病变(lymphoepithelial lesion，LEL)，因此可作为H.pylori研究的替代工具来研究胃 MALT淋巴瘤的发病机制。

目前研究[18]认为，H.pylori感染胃黏膜后可激活上皮细胞和固有免疫细胞，诱导IFN-γ、白细胞介素(Interleukin，IL)-1β等炎症因子的产生，作用于间质细胞使其分泌CXCL13、CCL19、CCL21等趋化因子，募集淋巴细胞形成获得性的MALT。近年来，我们研究[11]发现FDC分泌的CXCL13与滤泡B细胞分泌的IFN-γ在H.suis感染后胃淋巴滤泡形成过程中的重要作用：即腹腔注射抗CXCL13抗体可明显抑制H.suis感染的小鼠胃黏膜中MALT的形成；IFN-γ基因缺陷小鼠感染H.suis6个月后未见胃淋巴滤泡形成，而给予来源于野生型小鼠的B细胞过继转移后，IFN-γ的表达与胃淋巴滤泡重新出现，表明H.suis感染后胃MALT的形成依赖于B细胞分泌的IFN-γ。此外，IFN-γ的上调可能通过诱导CXCL13的表达进而募集B淋巴细胞迁移至胃黏膜参与了胃MALT的形成[12]。因此，IFN-γ是H.suis感染后胃MALT形成的关键因子。

肥胖是由不同炎症因子诱导产生的一种全身性的慢性低度炎症状态，可增加罹患恶性淋巴瘤的风险。研究[19]发现，肥胖时血清瘦素水平升高，且脂肪组织Ob mRNA表达量增加 ,说明肥胖时个体对瘦素的反应减弱,此现象称为瘦素抵抗。大部分肥胖是由于对瘦素的继发性抵抗造成的，其原因可能与瘦素在血脑屏障处转运出现饱和、瘦素/Ob-R突变或下丘脑反馈信号被干扰，导致血清瘦素水平升高有关。研究[20]表明，肥胖与食管癌、结肠癌、胃癌、胆囊癌等多种消化道恶性肿瘤的发生相关，可增加这些疾病的发生风险。肥胖促肿瘤的发生机制与多种因素有关，而瘦素的高表达是其中一个重要原因。相关研究[21]表明，瘦素可刺激多种细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等分泌，进而促进细胞增殖及新生血管的生成；许多肿瘤组织中瘦素与Ob-R呈高表达，参与了肿瘤细胞的恶性生长与远处转移。另一方面，瘦素还可由正常胃黏膜组织分泌，其受体Ob-R高表达于B细胞淋巴瘤组织中。瘦素及其受体可通过激活 STAT3、ERK1/2 信号通路以及上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达，促进血管内皮细胞增殖和分化，诱导胃癌的发生、发展[15]。我们最近研究[7]发现，高脂饮食诱导的肥胖可明显促进H.suis感染后胃MALT的形成，并伴有瘦素表达水平的增高，为进一步研究肥胖促胃MALT形成的机制是否与瘦素上调有关，我们同时感染Ob/Ob小鼠与正常野生型小鼠12周并进行对比。Ob/Ob小鼠含有Ob基因，该基因为6号染色体隐性基因，纯合子可导致单纯肥胖并存在瘦素分泌缺陷；这种小鼠的肥胖症与人类的肥胖症很相似，可导致多种代谢失调，包括脂肪形成增加、分解减少。通过研究对比我们发现，WT+HS组小鼠胃黏膜中可见明显的淋巴滤泡形成，同时胃组织中Ob-R、IFN-γ、CXCL13的mRNA表达水平明显上调；而Ob/Ob小鼠感染H.suis后胃黏膜中无淋巴滤泡形成，且胃组织中Ob-R、IFN-γ、CXCL13的mRNA表达水平较WT+HS组明显降低，因此我们认为H.suis感染后胃黏膜瘦素表达水平的上调可能通过促进IFN-γ的分泌参与了胃MALT形成。为证实该假说，我们体外培养了人B细胞淋巴瘤细胞株，并加入不同浓度的瘦素刺激24 h或48 h后分别在蛋白水平与mRNA水平检测培养液与细胞中IFN-γ的表达，结果显示，瘦素可刺激B细胞分泌IFN-γ，并具有浓度与时间依赖性。瘦素作为一种促炎因子, 可刺激TNF-α、IL-6、IL-12等多种炎症因子的分泌，并参与Th1/Th2细胞因子之间的平衡调节，还可通过激活JAK2/STAT3和p38MAPK/ERK1/2等信号通路，维持细胞增殖和自身免疫性疾病的易感性[15]。此外，瘦素还具有诱导中性粒细胞的趋化作用，可通过促进氧自由基的释放，诱导蛋白质变性并损伤膜脂质，来影响细胞内稳态，间接发挥促癌效应。 因此，我们认为H.suis感染后胃黏膜瘦素的高表达很可能也通过促炎效应参与了淋巴细胞性胃炎的发生。

综上所述，本研究发现瘦素可能通过促进IFN-γ的分泌表达在H.suis感染后胃MALT的形成过程中发挥重要作用。今后对瘦素及其受体后信号传导通路进行深入探讨有望为螺杆菌感染后胃MALT形成机制及肥胖促癌机制的相关研究提供理论基础。

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(责任编辑：马 军)

Theeffectofleptinontheformationofgastricmucosa-associatedlymphoidtissueafterHelicobactersuisinfection

LIU Yaqian1, ZHANG Cuiping1, TIAN Zibin1, YANG Lin1, YU Ya’nan1, YANG Ruoming1, LI Xiaoyu1, ZHAO Wenjun1, REN Linlin1, ZHANG Shuaiqing2

1.Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003; 2.Department of Gastroenterology, Qilu Hospital of Shandong University, China

ObjectiveTo investigate the effect of leptin on the formation of gastric mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) after Helicobacter suis (H.suis) infection and its possible mechanism.MethodsTwenty female C57BL/6 wild type mice and twenty leptin-deficient (Ob/Ob) mice were randomly divided into four groups (ten mice per group)： normal uninfected wild type (WT) group,H.suisinfected wild type (WT+HS) group, uninfected Ob/Ob (Ob) group andH.suisinfected Ob/Ob (Ob+HS) group. At 12 weeks after infection, the serum and gastric tissue samples were collected from each mouse. The number and size of gastric lymphoid follicles were detected by HE staining and the expression of leptin in serum was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The expressions of leptin and its receptor Ob-R, inflammatory cytokine IFN-γ and chemokine CXCL13 mRNA in the gastric mucosa were detected by real-time PCR.ResultsThe formation of gastric lymphoid follicles was observed in the gastric mucosa of WT group. Compared with WT + HS group, the expression of leptin was not detected in the serum and gastric mucosa and the formation of gastric lymphoid follicles was not observed in Ob+HS group. The expressions of IFN-γ and CXCL13 mRNA in the gastric mucosa of Ob+HS group were also reduced significantly. Vitro experiments results showed that leptin can stimulate lymphoma B cells to secret IFN-γ.ConclusionLeptin may be involved in the formation of gastric MALT afterH.suisinfection via the up-regulation of IFN-γ in the gastric mucosa.

Leptin; Helicobacter suis; IFN-γ; Gastric mucosa-associated lymphoid tissue

国家自然科学基金面上项目(81572320)；国家自然科学基金青年项目(81502025)

刘亚倩，硕士研究生，研究方向：消化道肿瘤基础与临床。E-mail: lyq_118@163.com

杨林，副主任医师，研究方向：消化道肿瘤基础与临床。E-mail: bobotony@126.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.11.022

R573.9

A

1006-5709(2017)11-1285-05

2017-05-25