马来酸伊索拉定联合三联疗法对幽门螺杆菌感染小鼠治疗作用的实验研究

杜小曼， 成 虹， 刘建湘， 王化虹， 李 江， 胡伏莲

北京大学第一医院消化内科，北京 100034



论著·幽门螺杆菌

马来酸伊索拉定联合三联疗法对幽门螺杆菌感染小鼠治疗作用的实验研究

杜小曼， 成 虹， 刘建湘， 王化虹， 李 江， 胡伏莲

北京大学第一医院消化内科，北京 100034

目的 观察马来酸伊索拉定(Irsogladine Maleate，IM)联合三联疗法对幽门螺杆菌(H.pylori)感染小鼠的根除作用其及对H.pylori所致胃黏膜炎症的修复作用。方法 60只KM小鼠随机分为6组，空白对照组、H.pylori感染模型组和4个药物治疗组。治疗组分别给予标准三联、铋剂四联、小剂量IM+标准三联及大剂量IM+标准三联药物灌胃治疗。快速尿素酶试验(RUT)联合组织病理学Giemsa染色判断H.pylori根除情况，HE染色判断胃黏膜炎症情况。结果 标准三联组7例H.pylori根除成功，铋剂四联组、小剂量IM+标准三联组及大剂量IM+标准三联组均有8例根除成功，四组根除率两两比较，差异无统计学意义(P>0.05)。大剂量IM+标准三联组对胃黏膜慢性炎性反应的修复作用与铋剂四联组相当，优于标准三联组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 大剂量或小剂量IM联合标准三联对H.pylori感染小鼠的H.pylori根除率与铋剂四联相当，略高于标准三联，IM联合标准三联可明显改善H.pylori感染根除后的胃黏膜慢性炎性反应，且具有剂量依赖性。

马来酸伊索拉定；幽门螺杆菌；根除作用；胃黏膜炎症

幽门螺杆菌(H.pylori)感染与消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌及胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤等多种上消化道疾病密切相关，根除H.pylori治疗是上述疾病治疗的关键环节[1]。随着全球范围内H.pylori对抗生素耐药情况日益严重，目前根除H.pylori的标准三联疗法在很多国家和地区的根除率已经低于80%[2]。马斯特里赫特V/佛罗伦萨H.pylori感染共识报告及中国第四次全国H.pylori感染处理共识报告均提出在耐药严重地区，推荐使用以铋剂为基础的四联疗法作为临床治疗的一线方案[1-3]。铋剂是临床常用的胃黏膜保护剂，同时对H.pylori有一定的杀菌作用，其与抗生素联合可以提高根除治疗的疗效[4]。但铋剂作为重金属制剂，不宜长期服用，且有导致严重的急性肾损伤、铋性脑病等相关报道，严重脑血管病、肾功能不全、对铋剂过敏等患者均不宜应用铋剂[5]，在部分国家和地区铋剂甚至被禁用。此外，铋剂四联疗法的不良反应发生率明显增加，某些研究显示可达40%，增加患者不适的同时也明显影响了患者服药的依从性[2]。寻求更安全、更有效的方案来应对根除H.pylori所面临的严峻问题，是目前医学界的热点之一。

马来酸伊索拉定(Irsogladine Maleate，IM)是一种黏膜保护剂，临床上主要用于急慢性胃炎、胃溃疡[6]的治疗，也有相关临床及实验室研究显示IM具有预防和修复非甾体类抗炎药导致的消化道损伤[7]、治疗口腔炎症[8]等作用，IM临床应用的不良反应发生率较低。目前关于IM对H.pylori感染的治疗作用尚不明确。本研究通过动物实验探索IM联合三联疗法对H.pylori感染小鼠根除治疗作用及其对H.pylori感染所致胃黏膜损伤的修复作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：昆明(KM)小鼠：6周龄，SPF级，雄性，18～22 g，共60只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2013-0170。饲养于本院动物中心SFP饲养室，饲养条件：室温20～22 ℃，湿度55%，12 h明暗交替，随意饮水及进食消毒固体饲料。

1.1.2H.pylori菌株：H.pylori悉尼株(Sydney Strain 1，SS1)：英国伦敦国家标准培养物收藏中心赠予，于本院消化科实验室冻存。

1.1.3 实验药物：马来酸伊索拉定(日本新药株式会社)，兰索拉唑(天津武田药品有限公司)，克拉霉素、甲硝唑、枸橼酸铋钾(丽珠集团丽珠制药厂)。

1.2 实验方法

1.2.1H.pylori培养和菌液制备：将-80 ℃冻存的H.pyloriSS1菌株解冻，取100 μl菌液均匀接种于哥伦比亚琼脂和新鲜脱纤维素羊血(浓度百分比8%)配制的固体培养基表面，置于37 ℃、微需氧(体积分数15%二氧化碳、5%氧气、80%氮气)条件下培养48～72 h。复苏成功后的菌落经快速尿素酶试验(RUT)及Giemsa染色显微镜观察进行鉴定后，于上述相同条件下传代增菌。无菌接种环收集H.pylori菌落于细菌冻存液脑心浸液中，比浊法调整菌悬液浓度为4麦氏浊度，即1.2×109CFU/ml。

1.2.2 建立动物模型：在适应性饲养后，所有模型组小鼠均给予200 mg/kg环磷酰胺腹腔注射一次预处理，第2天开始给予H.pyloriSS1菌液(0.1 ml/10 g)灌胃，隔日一次，共5次，灌胃后常规饲养2周。

1.2.3 实验动物分组及处理：60只KM小鼠随机分为6组，分别为空白对照组、H.pylori感染模型对照组和4个药物治疗组。药物治疗组于建模后2周分别给予标准三联、铋剂四联、小剂量IM+标准三联、大剂量IM+标准三联的药物治疗。标准三联：兰索拉唑4.55 mg/kg、克拉霉素75 mg/kg、甲硝唑60 mg/kg；铋剂四联：枸橼酸铋钾33 mg/kg联合标准三联；小剂量IM+标准三联：IM 0.5 mg/kg联合标准三联；大剂量IM+标准三联：IM 1.5 mg/kg联合标准三联。上述剂量的药物通过灌胃给予，2次/d，连续10 d。空白组及H.pylori感染模型组同时给予灭菌纯水灌胃作为对照。

1.2.4 观察指标与检测方法：(1)一般情况：观察小鼠进食、饮水及昼夜活动情况，记录体质量变化情况。(2)H.pylori根除率的判定和胃黏膜炎症的观察：动物处死后，剖腹取全胃，沿胃大弯剪开，以生理盐水冲洗净胃内容物。① 取一半胃的胃窦和胃体组织进行RUT检测，观察24 h。② 另一半标本，剪取胃体和胃窦，于10%中性甲醛固定，随后进行脱水、包埋、切片等步骤制成石蜡切片，分别进行Giemsa染色及HE染色，由病理科医师协助镜检，观察H.pylori定植及胃黏膜炎症情况，胃黏膜炎症情况的判断以《中国慢性胃炎共识意见(2012，上海)》5项组织学变化及4项分级为依据及标准[9]。分别计算各组的炎性反应积分：无炎性反应=1分，轻度慢性炎性反应或轻度活动性炎症=2分，中度慢性炎性反应或中度活动性炎症=3分，重度慢性炎性反应或重度活动性炎症=4分。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计数资料采用行×列(R×C)表资料的检验，以n表示总频数，以T表示理论频数。当n≥40且所有T≥5时，使用Pearsonχ2检验；当n≥40但1≤T≤5时，使用连续校正χ2检验；当n<40或T<1时，使用Fisher’s精确检验。对两样本均数差别的显著性检验采取两独立样本的t检验。多样本均数差别的显著性检验采用方差分析(analysis of variance，ANOVA)。有序分类变量采取两个或多个样本的秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 实验过程中各组大鼠无死亡，各组动物精神状态良好，进食、活动可，毛发浓密程度及光泽度均可，空白对照组体质量较其他组增加迅速。处死实验动物并取材当天各组体质量如图1所示。

各组的平均体质量分别为：空白对照组(38.5±1.4)g，H.pylori感染对照组(33.4±1.6)g，标准三联组(34.3±1.4)g，铋剂四联组(34.8±1.4)g，小剂量IM+标准三联组(34.1±1.4)g，大剂量IM+标准三联组(34.2±1.4)g。空白组平均体质量高于其他各组，与其他各组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，而其余各组间体质量差异无统计学意义(P>0.05)。

注：*P<0.01。图1 实验结束小鼠体质量Fig 1 The body weight of mice at the end of the experiment

2.2H.pylori根除情况 RUT测定方法如前文所述，Giemsa染色阳性者可见到深蓝色粗杆状，略呈S状的菌体。结合两种方法判断H.pylori感染及根除情况。结果显示，空白对照组全部10例RUT及Giemsa染色均为阴性，感染对照组全部10例RUT及Giemsa染色均为阳性，提示建模成功。小剂量IM+标准三联、大剂量IM+标准三联组与铋剂四联组均有8例根除成功，标准三联组7例根除成功，采用Fisher’s精确概率法计算4组的根除率差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 胃黏膜损伤及炎症情况 肉眼观察获取的实验动物全胃大体标本，所有实验组均未见明显溃疡及充血、水肿等变化(见图2)。本实验观察到胃黏膜为正常或轻度慢性炎性反应及轻度活动性炎，图2为正常胃黏膜，图3高倍镜视野下可观察到黏膜内少量单核细胞浸润，浸润局限于黏膜浅层，不超过黏膜的1/3，同时观察到少量中性粒细胞，且黏膜结构紊乱。未观察到中重度炎性反应和黏膜的萎缩、肠化。按照前文实验方法的描述进行黏膜炎症积分计算，H.pylori感染对照组的慢性炎性反应积分和活动性炎症积分明显高于空白组和治疗组(见表1)。为了排除H.pylori根除率的不同对黏膜炎症结果的影响，将治疗组已根除H.pylori的小鼠炎症做单独分析(见表2)。采用两独立样本的秩和检验方法比较各组间的黏膜炎症情况，慢性炎性反应方面：大剂量IM+标准三联组优于标准三联组，差异具有统计学意义(P<0.05)；大剂量IM+标准三联组与铋剂四联组之间差异无统计学意义，其他各组两两之间差异也无统计学意义(P>0.05)。活动性炎症方面4个治疗组间差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 基本正常胃黏膜(HE 400×)；图3 胃黏膜炎症细胞浸润，红色圈内为炎症细胞(HE 400×)

Fig 2 Normal gastric mucosa (HE 400×); Fig 3 Inflammatory cell infiltration in the gastric mucosa and inflammatory cells in the red circle (HE 400×)

表1 各组小鼠胃黏膜炎症分布

Tab 1 Distribution of gastric mucosa inflammation in mice of each group

分组慢性炎性反应-+++～+++积分活动性炎症-+++～+++积分空白对照组100010100010H．pylori感染对照组01002028018标准三联组4601691011铋剂四联组7301391011小剂量IM+标准三联组6401491011大剂量IM+标准三联组8201291011

表2 已根除H.pylori小鼠胃黏膜炎症分布

Tab 2 Distribution of gastric mucosal inflammation in mice thatH.pylorihad been eradicated

分组慢性炎性反应-+++～+++活动性炎症-+++～+++标准三联组430610铋剂四联组710800小剂量IM+标准三联组620710大剂量IM+标准三联组800800

3 讨论

由于根除率的下降和四联方案不良反应的偏高，寻求更安全、更有效的H.pylori根除方案是目前医学界的热点之一。除铋剂以外，有关其他胃黏膜保护剂如伊卡倍特钠等应用于H.pylori根除治疗的相关研究也在进行[10]。本结果研究显示IM联合标准三联对于H.pylori感染的根除作用与铋剂四联相当，高于标准三联组，但还有待进一步通过扩大样本量研究进一步明确其作用及其可能的机制。已有临床研究显示，IM的不良反应发生率很低，主要为轻微的肝功能异常、便秘等，尚未观察到危及生命的不良反应发生[6]。药理学研究也发现，IM虽可轻度抑制CYP2C9和CYP1A2，但临床应用的剂量和药物浓度远低于其可产生抑制作用的浓度，故临床应用中IM通常不与其他药物产生明显的相互作用[11]。上述研究为IM联合标准三联未来应用于临床根除H.pylori治疗的有效和安全性提供了一定的依据。

既往研究显示,IM对多种因素导致的消化道黏膜损伤具有保护作用，如减轻吲哚美辛等非甾体抗炎药导致的胃、小肠和食管等全消化道黏膜的损伤，且效果优于瑞巴派特和替普瑞酮[7，12]。临床研究显示IM对于牙周炎症以及复发性阿弗他口炎具有良好的治疗效果[8]。在联合一般治疗的基础上，IM保留灌肠较对照组更能改善活动期溃疡性结肠炎患者的临床症状和结肠镜下缓解[13]。日本学者研究发现，IM较法莫替丁显示出更强的促进H.pylori根除治疗后胃溃疡的修复作用[6]。IM对消化道黏膜保护作用的相关机制研究显示，其可通过调控TNF-α等细胞因子强化细胞间缝隙连接通讯作用[14]，通过影响内生型一氧化氮合酶(cNOS)的作用改善胃黏膜的血流量[15]，通过抑制中性粒细胞的Ⅳ型磷酸二酯酶减少细胞损伤因素过氧化物的产生[16]，也可通过减少白介素12和白介素23的产生而减少炎症反应[17]。此外，IM可抑制由于H.pylori感染、药物、酒精等引起的胃黏膜疏水性下降[18]。一些研究显示，IM的黏膜保护作用具有一定的剂量依赖性。本研究结果显示，在改善根除H.pylori后的黏膜慢性炎症方面，大剂量IM+标准三联组与铋剂四联组相当，优于标准三联组。提示IM可促进H.pylori感染的胃黏膜慢性炎症的修复，且具有剂量依赖性。

本研究中全部实验动物均未观察到胃黏膜萎缩、肠化，考虑与本研究H.pylori定植时间短，尚不足以造成显著的黏膜萎缩有关。既往研究显示，H.pyloriSS1菌株在BALB/c小鼠定植6个月、在C57BL/c小鼠定植8个月，方可观察到胃黏膜萎缩的发生[19]。

目前,应用比较广泛的H.pylori感染动物模型为由鼠适应菌株—悉尼菌株(SS1菌株)[19]构建的小鼠模型。本研究团队既往应用环磷酰胺预处理的方法成功实现了SS1菌株在昆明(KM)小鼠的稳定定植[20]，故本研究选择应用了该动物模型。该模型利用一次性大剂量给予环磷酰胺(200 mg/kg)对小鼠产生一过性免疫抑制作用而促进H.pylori定植[21]，免疫抑制作用于注射环磷酰胺后第8天开始恢复，故不会对后续治疗造成影响。既往研究显示环磷酰胺会导致实验动物体质量下降，在本实验中也观察到造模组较空白组体质量偏低的现象；本实验中各造模组的体质量无显著性差异，分析认为H.pylori感染及给予不同治疗药物等因素不影响体质量变化。本实验H.pylori感染对照组全部小鼠建模成功；空白组未发现细菌定植，提示饲养隔离良好，未出现组间食物、饮水污染而造成H.pylori交叉感染。可依此认定本实验治疗结果的可靠性。

IM联合三联疗法对H.pylori的根除作用与铋剂四联相当，略高于标准三联，其结果有待进一步扩大样本量研究证实。IM联合三联疗法可改善H.pylori感染小鼠根除治疗后的胃黏膜慢性炎性反应，其作用具有剂量依赖性，大剂量IM联合三联疗法的炎性修复作用与铋剂四联相当，且显著优于标准三联。

[1]Malfertheiner P, Megraud F, O’Morain CA, et al. Management of Helicobacter pylori infection-the Maastricht V/Florence Consensus Report [J]. Gut, 2017, 66(1): 6-30.

[2]Gao XZ, Qiao XL, Song WC, et al. Standard triple, bismuth pectin quadruple and sequential therapies for Helicobacter pylori eradication [J]. World J Gastroenterol, 2010, 16(34): 4357-4362.

[3]中华医学会消化病学分会幽门螺杆菌学组/全国幽门螺杆菌研究协作组, 刘文忠, 谢勇, 等. 第四次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告[J]. 现代消化及介入诊疗, 2012, 17(6): 358-363.

[4]成虹, 李江, 胡伏莲. 枸橼酸铋钾对幽门螺杆菌耐药菌株体外抗菌活性研究[J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 2008, 17(7): 543-546. Cheng H, Li J, Hu FL. Vitro activity of bismuth potassium citrate against clinical isolates of antibiotic-resistant Helicobacter pylori [J]. Chin J Gastroenterol Hepatol, 2008, 17(7): 543-546.

[5]Teepker M, Hamer HM, Knake S, et al. Myoclonic encephalopathy caused by chronic bismuth abuse [J]. Epileptic Disord, 2002, 4(4): 229-233.

[6]Murakami K, Okimoto T, Kodama M, et al. Comparison of the efficacy of irsogladine maleate and famotidine for the healing of gastric ulcers after Helicobacter pylori eradication therapy: a randomized, controlled, prospective study [J]. Scand J Gastroenterol, 2011, 46(3): 287-292.

[7]Kuramoto T, Umegaki E, Nouda S, et al. Preventive effect of irsogladine or omeprazole on non-steroidal anti-inflammatory drug-induced esophagitis, peptic ulcers, and small intestinal lesions in humans, a prospective randomized controlled study [J]. BMC Gastroenterol, 2013, 13: 85.

[8]Hayashi N, George J, Shiroeda H, et al. Irsogladine maleate for the treatment of recurrent aphthous stomatitis in hepatitis C virus patients on pegylated-interferon and ribavirin: a pilot study [J]. J Gastroenterol Hepatol, 2013, 28(6): 1015-1018.

[9]中华医学会消化病学分会, 房静远, 刘文忠, 等. 中国慢性胃炎共识意见(2012年，上海)[J]. 中华消化杂志, 2013, 33(1): 5-16.

[10]梁洁, 吴开春, 杨云生, 等. 依卡倍特钠四联疗法根除幽门螺杆菌的临床试验：全国多中心临床研究[J]. 中华消化杂志, 2012, 32(10): 662-664. Liang J, Wu KC, Yang YS, et al. Clinical trial on ecabet sodium-based quadruple therapy for Helicobacter pylori eradication：a multicenter clinical study [J]. Chin J Dig, 2012, 32(10): 662-664.

[11]Nakamura A, Tougou K, Kitazumi H, et al. Effects of irsogladine on P450-isoform specific activities in human hepatic microsomes [J]. Arzneimittelforschung, 2006, 56(7): 547-552.

[12]Kamei K, Kubo Y, Kato N, et al. Prophylactic effect of irsogladine maleate against indomethacin-induced small intestinal lesions in rats [J]. Dig Dis Sci, 2008, 53(10): 2657-2666.

[13]杨锐. 伊索拉定灌肠治疗溃疡性结肠炎的临床疗效观察[D]. 长春：吉林大学, 2012.

[14]Fujita T, Yumoto H, Shiba H, et al. Irsogladine maleate regulates epithelial barrier function in tumor necrosis factor-α-stimulated human gingival epithelial cells [J]. J Periodontal Res, 2012, 47(1): 55-61.

[15]Kyoi T, Oka M, Noda K, et al. Irsogladine prevents monochloramine-induced gastric mucosal lesions by improving the decrease in mucosal blood flow due to the disturbance of nitric oxide synthesis in rats [J]. J Pharmacol Sci, 2003, 93(3): 314-320.

[16]Kyoi T, Noda K, Oka M, et al. Irsogladine, an anti-ulcer drug, suppresses superoxide production by inhibiting phosphodiesterase type 4 in human neutrophils [J]. Life Sci, 2004, 76(1): 71-83.

[17]Nakagawa T, Katsuno T, Noguchi Y, et al. Irsogladine maleate prevents colitis in interleukin-10 gene-deficient mice by reducing interleukin-12 and -23 production [J]. Biol Pharm Bull, 2015, 38(11): 1681-1688.

[18]Tatsumi Y, Tanino M, Kodama T, et al. Irsogladine maleate may preserve gastric mucosal hydrophobicity against ethanol in phospholipids independent way in rats [J]. Jpn J Pharmacol, 1998, 77(4): 293-299.

[19]Lee A, O’Rourke J, De Ungria MC, et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain [J]. Gastroenterology, 1997, 112(4): 1386-1397.

[20]叶晖, 李宁, 于靖, 等. 昆明小鼠感染幽门螺杆菌动物模型的建立[J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 2015, 24(3): 284-286. Ye H, Li N, Yu J, et al. The establishment of animal model by Helicobacter pylori infected Kunming mice [J]. Chin J Gastroenterol Hepatol, 2015, 24(3): 284-286.

[21]徐海帆, 李汉贤. 免疫抑制小鼠不同时间环磷酰胺的血药浓度与免疫功能[J]. 南华大学学报·医学版, 2001, 29(6): 562-564. Xu HF, Li HX. Serum concentration of CTX and immunofunction in immunosuppressed mice at different time [J]. Journal of Nanhua University (Medical Edition), 2001, 29(6): 562-564.

(责任编辑：马 军)

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《胃肠病学和肝病学杂志》编辑部

The therapeutic effects of Irsogladine Maleate combined with triple therapy in Helicobacter pylori infective mice

DU Xiaoman, CHENG Hong, LIU Jianxiang, WANG Huahong, LI Jiang, HU Fulian

Department of Gastroenterology, the First Hospital of Peking University, Beijing 100034, China

Objective To observe the eradication effects of Irsogladine Maleate (IM) in Helicobacter pylori (H.pylori) infective mice and the influence on gastric mucosal inflammation. Methods Sixty KM mice were randomly divided into 6 groups, including blank control group,H.pyloriinfective control group and 4 treatment groups. The treatment groups were given standard triple therapy, bismuth-based quadruple therapy, low-dose IM+standard triple therapy and high-dose IM+standard triple therapy, respectively. After sacrifice, rapid urease tests (RUT) combined with pathological Giemsa staining were used to demonstrate eradication rate ofH.pylori. HE staining of gastric mucosal was used to survey the inflammatory status. Results The eradication rates of bismuth-based quadruple therapy, low-dose IM+standard triple group and high-dose IM+standard triple group were 80.0%, higher than standard triple group (70.0%), the eradication rate ofH.pyloriin 4 treatment groups had no significant difference (P>0.05). Repair effect of chronic inflammatory reaction of gastric mucosa of high-dose IM+standard triple therapy group was similar to the bismuth-based quadruple therapy, and better than standard triple therapy group, there was significantly different (P<0.05). Conclusion IM+standard triple therapy can reach the same eradication rate compared with bismuth-based quadruple therapy, with a tendency of higher than triple therapy. IM+standard triple group can significantly improve the chronic inflammatory reaction of gastric mucosa after eradication ofH.pyloriinfection, with a dose dependent manner.

Irsogladine Maleate; Helicobacter pylori; Eradication; Gastric mucosal inflammation

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.06.009

杜小曼，博士。E-mail： xiaoman_du@163.com

成虹，E-mail： chenghong@medmail.com.cn

R378

A

1006-5709(2017)06-0653-05

2017-05-15